冶貴生

摘要：研究Ｄ型產(chǎn)氣莢膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）青海分離株ε毒素基因的遺傳變異特點(diǎn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增ε毒素基因，目的基因片段大小為８８８ ｂｐ。建立ＰＣＲ反應(yīng)體系并設(shè)置反應(yīng)條件，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)、純化、測(cè)定核苷酸序列，與參考序列進(jìn)行同源比對(duì)分析。結(jié)果表明，目的基因擴(kuò)增良好，分離菌株ＷＣ－ｅｐｓｉｌｏｎ－ＦＬ與菌株Ｃ６０－３、ＮＣＴＣ ８３４６、Ｍｕｋｔｅｓｈｗａｒ、ＡＪ２５０９５６的核苷酸序列的同源性依次為９９．９％、９９．８％、９８．９％、９９．４％。

關(guān)鍵詞：Ｄ型產(chǎn)氣莢膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）；ε毒素；遺傳變異

中圖分類號(hào)：Ｓ８５２文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）15－3183-03

Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ε Ｔｏｘｉｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ Ｔｙｐｅ Ｄ Iｓｏｌａｔｅｄ from Ｑｉｎｇｈａｉ

ＹＥ Ｇｕｉ－ｓｈｅｎｇ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ， Ｑｉｎｇｈａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｉｎｇ ８１００１６，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ε ｔｏｘｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｔｙｐｅ Ｄ isolated from Qinghai，ｐｒｉｍｅｒｓ of which PCR product length was 888 bp was designed ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ε ｔｏｘｉｎ ｇｅｎｅ． Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ was ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ； ｔｈｅｎ its ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ was analyzed． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｏｘｉｎ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｖｅｒｙ ｗｅｌｌ， ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｒａｔｅ was ９９．９％、９９．８％、９８．９％、９９．４％ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｑｉｎｇｈａｉ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｓｔｒａｉｎ Ｃ６０－３， ｓｔｒａｉｎ ＮＣＴＣ ８３４６， ｓｔｒａｉｎ Ｍｕｋｔｅｓｈｗａｒ， ｓｔｒａｉｎ ＡＪ２５０９５６ ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｔｙｐｅ Ｄ； ε ｔｏｘｉｎ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ

產(chǎn)氣莢膜梭菌又稱魏氏梭菌，是一種人畜共患病的革蘭氏陽(yáng)性菌，產(chǎn)芽胞，在自然界分布極廣，土壤、飼料、蔬菜等均有分布。產(chǎn)氣莢膜梭菌分型較多，其中Ｄ型產(chǎn)氣莢膜梭菌嚴(yán)重危害養(yǎng)羊業(yè)，其引起的疾病為羊腸毒血癥，該病潛伏期短，發(fā)病快，死亡快［１］。Ｄ型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要產(chǎn)生α和ε兩種毒素，其中α毒素具有磷脂酶的活性［２］，ε毒素前體被激活后會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性并增加血管滲透性［３］。青海地處青藏高原，是我國(guó)重要的牧區(qū)之一，綿羊養(yǎng)殖業(yè)在青海牧區(qū)養(yǎng)殖業(yè)中所占比重較大，鑒于產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病特點(diǎn)，該菌對(duì)青海省養(yǎng)羊業(yè)構(gòu)成一定程度的威脅，因此，本研究通過(guò)測(cè)定并分析Ｄ型產(chǎn)氣莢膜梭菌青海分離株ε毒素基因的核苷酸變異特點(diǎn)，旨在為青海省產(chǎn)氣莢膜梭菌病的防治提供基礎(chǔ)依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１菌株Ｄ型產(chǎn)氣莢膜梭菌為臨床分離并保存于青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

１．１．２試劑Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶為寶生物（大連）有限公司產(chǎn)品，細(xì)菌基因組提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ?yàn)閷毶铮ù筮B）有限公司產(chǎn)品，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基為北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

１．１．３引物根據(jù)ＮＣＢＩ上登錄的產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，預(yù)期目的片段大小為８８８ ｂｐ。上游引物：５′－ＡＡＧＧＡＡＡＴＡＴＣＴＡＡＴＡＣＡＧＴＡＴＣＴＡＡＴＧ－３′；下游引物：５′－ＴＴＴＴＡＴＴＣＣＴ

ＧＧＴＧＣＣＴＴ－３′。

１．２方法

１．２．１增菌培養(yǎng)按培養(yǎng)基說(shuō)明書配制，無(wú)菌操作進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌的厭氧培養(yǎng)。

１．２．２ＤＮＡ提取參照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

１．２．３毒素基因的ＰＣＲ擴(kuò)增反應(yīng)體系：Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ、ｄＮＴＰ ４ μＬ、上游引物 １ μＬ、下游引物 １ μＬ、模板 １ μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶 ０．５ μＬ、補(bǔ)滅菌水至５０ μＬ。反應(yīng)條件：９４ ℃ １ ｍｉｎ、４７ ℃ １ ｍｉｎ、７２ ℃ １ ｍｉｎ，３５個(gè)循環(huán)，然后７２ ℃ １０ ｍｉｎ，４ ℃ 保存。

１．２．４擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)束后?。?μＬ擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行１％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。

１．２．５序列分析將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后測(cè)序并進(jìn)行同源性分析。

２結(jié)果與分析

２．１ε毒素基因ＰＣＲ擴(kuò)增檢測(cè)

ε毒素基因所在泳道２出現(xiàn)目的條帶，目的基因條帶清晰，表明擴(kuò)增效果良好（圖１）。

２．２ε毒素基因核苷酸序列分析

應(yīng)用ＤＮＡｓｔａｒ軟件對(duì)所測(cè)菌株ε毒素基因核苷酸進(jìn)行分析，結(jié)果表明（表1）所測(cè)青海分離株ε毒素基因Ａ＋Ｔ含量較高，其堿基組成含有較多的腺嘌呤和胸腺嘧啶。

２．３ε毒素基因核苷酸序列同源性分析

選擇ＮＣＢＩ登錄的４株Ｄ型產(chǎn)氣莢膜梭菌（菌株Ｃ６０－３、ＮＣＴＣ ８３４６、Ｍｕｋｔｅｓｈｗａｒ、ＡＪ２５０９５６）的ε毒素基因與所測(cè)青海分離菌株ＷＣ－ｅｐｓｉｌｏｎ－ＦＬ進(jìn)行同源比對(duì)分析。比對(duì)結(jié)果表明，菌株ＷＣ－ｅｐｓｉｌｏｎ－ＦＬ的ε毒素基因與參考菌株核苷酸序列同源性依次為９９．９％、９９．８％、９８．９％、９９．４％（圖２），所測(cè)菌株與菌株 Ｃ６０－３之間有１處核苷酸突變；與菌株 ＮＣＴＣ ８３４６之間有２處核苷酸突變；與菌株Ｍｕｋｔｅｓｈｗａｒ之間有５處核苷酸突變；與菌株ＡＪ２５０９５６有２處核苷酸突變（圖３）。

３討論

Ｄ型產(chǎn)氣莢膜梭菌可產(chǎn)生α和ε兩種毒素，毒素是該菌致病的主要因素，ε毒素編碼基因位于細(xì)菌大質(zhì)粒上，當(dāng)細(xì)菌侵入宿主體內(nèi)后ε毒素以前體形式被分泌出來(lái)，在腸道內(nèi)毒素前體的Ｎ端和Ｃ端部分氨基酸被腸道內(nèi)的蛋白酶切除后轉(zhuǎn)變成有活性的毒素，從而造成機(jī)體組織器官的損傷。ε毒素可與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合并在膜上形成孔隙從而造成細(xì)胞內(nèi)外離子濃度的變化，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡。本研究所測(cè)Ｄ型產(chǎn)氣莢膜梭菌青海分離株ε毒素基因長(zhǎng)度為８８８ bp，從ε毒素基因序列同源性分析結(jié)果來(lái)看，菌株ＷＣ－ｅｐｓｉｌｏｎ－ＦＬ與菌株Ｃ６０－３親緣關(guān)系最近；與菌株ＮＣＴＣ ８３４６和菌株 ＡＪ２５０９５６的親緣關(guān)系次之；與菌株 Ｍｕｋｔｅｓｈｗａｒ親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。另外，從ε毒素基因序列同源性比對(duì)結(jié)果可知，菌株ＷＣ－ｅｐｓｉｌｏｎ－ＦＬ與菌株Ｃ６０－３之間１處的核苷酸突變，為Ｃ－Ａ突變；與菌株ＮＣＴＣ ８３４６之間的２處核苷酸突變，均為Ｃ－Ａ突變；與菌株Ｍｕｋｔｅｓｈｗａｒ之間的５處核苷酸突變，分別為2處Ｔ－Ｇ突變、１處Ｔ－Ａ突變、１處Ｇ－Ａ突變和１處Ａ－Ｔ突變；與菌株ＡＪ２５０９５６的２處突變?yōu)椋牵镣蛔兒停粒酝蛔?，上述突變均為點(diǎn)突變，這說(shuō)明Ｄ型產(chǎn)氣莢膜梭菌可通過(guò)ε毒素基因的變異來(lái)適應(yīng)不同的地域環(huán)境，通過(guò)遺傳變異加強(qiáng)自身適應(yīng)不同生存環(huán)境的能力。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 陳敷言．獸醫(yī)傳染病學(xué)［Ｍ］． 第五版．北京，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，２００６．３１５－３１６．

［２］ ＲＯＯＤ Ｊ Ｉ，ＭＣＣＬＡＮＥ Ｂ Ａ，ＳＯＮＧＥＲ Ｊ Ｇ，ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｃｌｏｓｒｒｉｄｉａ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｍ］． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７.２２３－２４２．

［３］ ＭＩＹＡＬＭＯＴＯ Ｏ， ＭＩＮＡＭＩ Ｊ， ＴＯＹＯＳＨＩＭＡ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｅｐｓｉｌｏｎ ｔｏｘｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ｖｉａ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ， １９９８，６６（6）：２５０１－２５０８．