符紅艷　于曉英　廖禎妮

摘要：從二氫黃酮醇4-還原酶基因結(jié)構(gòu)、基因的進(jìn)化、基因的表達(dá)特性及其在基因工程方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了概述和總結(jié)。

關(guān)鍵詞：DFR；基因結(jié)構(gòu)；表達(dá)特性；基因進(jìn)化；基因工程

中圖分類號(hào)：S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.06.004

1DFR基因在觀賞植物的呈色及花色素苷合成途徑中的作用

色彩是觀賞植物表現(xiàn)出來的一個(gè)重要特性，花、葉、果實(shí)等這些觀賞器官的顏色都決定著觀賞植物的觀賞價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。在高等植物中，花色和果色主要由類黃酮、類胡蘿卜素和甜菜色素三大色素所決定[1]。而類黃酮中的花色素苷則是影響花色的主要色素，賦予花和果實(shí)除綠色之外的其他顏色，如紅色、粉紅色、紫羅蘭色和藍(lán)色等，特定條件下還出現(xiàn)黑色[2]。

二氫黃酮醇4-還原酶(Dihydroflavonol 4-Reductase，DFR)在不同花色形成過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，它是把二氫黃酮醇轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄉ胤磻?yīng)的第一個(gè)酶[3]。類黃酮類色素的生物合成已經(jīng)較為清楚[3-4](圖1)。由苯丙氨酸到花青素的合成可以分為3個(gè)階段:第一階段由苯丙氨酸到香豆酰CoA,這是許多次生代謝都共有的;第二階段是由香豆酰CoA到二氫黃酮醇,這是類黃酮代謝的關(guān)鍵反應(yīng),它合成花青素和其它黃酮物質(zhì)；第三階段是各種花色素苷的合成。

在花色素苷合成的途徑中，DFR對(duì)花色素苷的最終形成起決定性作用。DFR是花色素苷生物合成中的關(guān)鍵性最初是在紫羅蘭的一個(gè)突變體中發(fā)現(xiàn)的[5]。其反應(yīng)需要NADPH參與。DFR依賴DHK、DHQ和DHM 3種底物，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上非常相似，只在B苯環(huán)上的輕基數(shù)目上不同。DFR能利用這3種底物，是因?yàn)镕3′H和F3′5′H兩種輕化酶的活性。F3′H能使DHK轉(zhuǎn)化成DHQ。F3′5′H則可以讓DHK轉(zhuǎn)化為DHM，還可以使DHQ轉(zhuǎn)化為DHM[6]。這是因?yàn)椴煌锓N的DFR對(duì)底物選擇性不同，合成了不同的花色素，就呈現(xiàn)出各異的花色[7]。就如矮牽牛的DFR缺乏還原底物DHK活性，所以其花瓣缺少橙色；而大丁草DFR能還原DHK，其花瓣就能產(chǎn)生橙色[8]。

2二氫黃酮醇4-還原酶基因結(jié)構(gòu)

1985年，OReiny C等[9]采用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)，首次從玉米和金魚草中分離出了DFR基因，1989年Beld等[10]用金魚草DFR基因作為探針分離出了矮牽牛DFR基因，相關(guān)研究者陸續(xù)采用同源克隆的方法已在多觀賞種植物中分離出了DFR基因（表1）。現(xiàn)有研究結(jié)果表明，DFR基因在植物的基因組中一般為單拷貝[5]，其為多基因家族的例子很少。裂葉牽牛（Ipomoeanil）與圓葉牽牛（I.purpurea）的基因組序列包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，金魚草、擬南芥與矮牽牛一樣的DFR基因也包含了5個(gè)內(nèi)含子；內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)均符合GT－AG法則[11]。陳大志等[12]在研究唇形亞綱植物DFR基因時(shí)表明，DFR表現(xiàn)為親水性。唇形亞綱植物DFR基因的空間結(jié)構(gòu)分為兩個(gè)部分為松散C-末端和致密球狀結(jié)構(gòu)。DFR與NADPH輔助因子的底物結(jié)合區(qū)域都在致密球狀結(jié)構(gòu)中。唇形亞綱植物DFR都含有一個(gè)NADB_Rossmann superfamily保守結(jié)構(gòu)域。

DFR為脫氫酶類，此類酶主要的特點(diǎn)是至少含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域即，第一個(gè)結(jié)構(gòu)域—輔酶的結(jié)合位點(diǎn)及第二個(gè)結(jié)構(gòu)域—催化作用位點(diǎn)。不同物種其DFR氨基酸序列存在一定區(qū)域的同源性，如在DFR與NADP結(jié)合位點(diǎn)，‘VTGAAGFIGSWLIMRLLERGY，為高度保守區(qū)[13]。DFR對(duì)不同底物的結(jié)合由其分子中底物結(jié)合區(qū)氨基酸序列所決定的，這個(gè)序列在不同物種中也高度保守。結(jié)合區(qū)中134位與145位的氨基酸殘基就直接影響酶的底物特異性，且大多數(shù)物種在134位含天冬氨酸殘基(D)或是天冬酞胺殘基(N)[14]。在矮牽牛以外的其他以DHK為底物的雙子葉植物中，就存在高度保守的145位谷氨酸殘基(E) [2]。祝婷等[15]利用DNAMAN軟件對(duì)苦蕎FtDFR和甜蕎FeDFR推導(dǎo)的氨基酸序列及同源蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，其發(fā)現(xiàn)在DFR蛋白質(zhì)序列中有一個(gè)NADP(H)結(jié)合保守區(qū)域VTGASGFVGSWLVMRLLEHGY，且存在一個(gè)底物特異性結(jié)合的保守區(qū)域TVNVEEKQKPVYDETCWSDVDFCRRV。

3二氫黃酮醇4-還原酶基因進(jìn)化

DFR依照第134位氨基酸殘基的不同將其可分為3類[16]：第一類為Asn型DFR，在絕大多種植物DFR中第134位氨基酸殘基為天冬酰胺殘基(N);第二類為Asp型DFR，其在134位上存在一個(gè)天冬氨酸殘基(D)，此類DFR不能有效地將DHK還原成無色花葵素，如矮牽牛、番茄和三花龍膽;第三類是DFR的第134位氨基酸殘基既不是天冬酰胺和天冬氨酸，又稱為非Asn/Asp型DFR，蔓越橘就在此位點(diǎn)為擷氨酸殘基(V)。Asn型的DFR在植物界中分布較廣，單子葉植物均為Asn型DFR。Asp型DFR僅分布在部分雙子葉植物中，而非Asn/Asp型DFR只在少數(shù)植物中存在。但由于Asp型和非Asn/Asp型DFR的數(shù)量有限，且在進(jìn)化上分布較遠(yuǎn)，由此可推測(cè)Asp型和非Asn/Asp型DFR有可能由Asn型進(jìn)化來的[7]。

孫桂平[17]等在對(duì)垂絲海棠花色素苷合成基因MhDFR的克隆時(shí)指出其MhDFR和蘋果(Malus domestica)、葡萄(Vitis vinifera)、西洋梨(Pyrus communis)等樹種的DFR序列均有較高的同源性，含有其家族同源基因相似的中央編碼區(qū)，且具有典型的DFR基因蛋白功能結(jié)構(gòu)域，屬于短鏈的脫氫酶及還原酶(SDR)家族。從序列比對(duì)結(jié)果的來看，不同樹種來源中的DFR具有較高的同源性，說明DFR在基因進(jìn)化過程中高度保守，同時(shí)也暗示DFR在花色素形成過程中起到重要的作用。據(jù)報(bào)道，植物DFR在第136位氨基酸的變化直接影響其對(duì)底物選擇的特異性[18]。在雙子葉植物中，存在于第136位是天冬氨酸(ASP，D)、天冬酞胺(Asn，N)和非D加型DFR[16]。陳大志[12]在研究唇形亞綱植物時(shí)發(fā)現(xiàn)其DFR基因間保持著很高的同源性和一致性，存在一定的密碼子偏好性，唇形亞綱植物的DFR基因均在各自的有機(jī)體中高表達(dá)。在唇形亞綱植物DFR基因地進(jìn)化過程中主要經(jīng)歷了純化選擇性壓力，且在進(jìn)化分支中經(jīng)歷了相同的選擇性壓力。唇形亞綱植物DFR基因的進(jìn)化速率不存在顯著差異，進(jìn)化的平均速率為(0.70±0.21) ×l0-9替換數(shù)/位點(diǎn)/年。祁銀燕等[19]通過聚類分析結(jié)果表明，單子葉植物風(fēng)信子的DFR基因，和單子葉植物的親緣關(guān)系較近。系統(tǒng)進(jìn)化樹體現(xiàn)了DFR在單子葉和雙子葉植物之間的區(qū)別，從風(fēng)信子中克隆出來的DFR基因先與鳶尾等單子葉植物聚類合并，最后才和雙子葉植物聚類，表明不同物種DFR基因進(jìn)化程度不同。也有人認(rèn)為，DFR的趨異可能發(fā)生于單子葉和雙子葉植物的趨異之后[20]。

4二氫黃酮醇4-還原酶基因的表達(dá)特性

4.1表達(dá)的部位

不同物種的DFR基因在不同部位與不同發(fā)育期的時(shí)空表達(dá)特性也有所不同[15]。但DFR在不同品種間的表達(dá)體現(xiàn)出空間專一性調(diào)控，其在花瓣中的表達(dá)與CHS和CHI相協(xié)調(diào)[21]?；ㄐ虬l(fā)育過程中, DFR基因在花器官、花冠內(nèi)和花類型的表達(dá)依照品種花色素苷顏色而變化[22]。

Nakatsuka等[23]在研究亞洲百合“Montreux”時(shí)發(fā)現(xiàn)，DFR在著色的器官如被片、花絲、花藥、雌蕊和紅色的鱗片中大量表達(dá)，而在未著色的莖、葉子和白色的鱗片中均不表達(dá)，且DFR的表達(dá)量隨花的生長(zhǎng)發(fā)育而增加，在開花期最大量的表達(dá)?？梢姡珼FR只在花色苷著色的器官中表達(dá)，其基因的表達(dá)量與花色苷的產(chǎn)生相一致[24]。Nakatsuka還在對(duì)雜種百合花研究發(fā)現(xiàn)LHDFR基因控制花器官表達(dá)模式，花瓣花青素積累伴隨著LHCHSA及LHDFR的表達(dá)，CHS和DFR對(duì)花被片及花瓣顏色的控制是獨(dú)立的。James等[25]通過探針標(biāo)記技術(shù)分離克隆了蔓越橘DFR基因且在煙草中成功的表達(dá)，且僅在花色素苷著色的器官中表達(dá)，與花色素苷的產(chǎn)生相協(xié)調(diào)[23]。劉娟等[1]認(rèn)為，DFR基因表達(dá)隨著花瓣組織的著色進(jìn)行，其時(shí)空表達(dá)特性基本上和花朵的著色模式相一致。

Murray等[26]研究發(fā)現(xiàn)，幼年期的常春藤在莖和葉柄中都有花色苷積累，此時(shí)DFR活性較高；到了成熟階段，雖體內(nèi)積累了大量的二氫黃酮醇，卻不能合成花色苷，檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)此時(shí)DFR沒有活性。郭晉雅等[24]的研究結(jié)果顯示，在不同生長(zhǎng)時(shí)期及同一生長(zhǎng)時(shí)期的各品種甘薯中，不同器官的DFR活性與其花色苷含量呈顯著線性正相關(guān)。文樵夫等[27]研究表明DFR在所有觀賞海棠葉片中均有表達(dá)，與葉色密切相關(guān)，葉色越紅的品種，其花色苷含量越高。矮牽牛的DFR-A基因在花冠、花藥及種子中表達(dá)量很高，在胚珠與莖中的表達(dá)量相對(duì)較少[28]。許志茹等[29]研究表明地被菊DgDFR1和DgDFR2在‘神韻和‘繁星粉兩品種的根、莖、葉中均不表達(dá)，但在花中特異性表達(dá)。郭鳳丹等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，花生DFR在花青素積累較多的果針中大量表達(dá)，在黑色種皮種子、深紅色種皮種子中的表達(dá)量明顯高于粉紅色和白色種皮種子中的表達(dá)量。周琳等[31]通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，牡丹DFR基因在花色素大量積累的花瓣中表達(dá)量最高，其次是萼片和雄蕊，再次是葉片，在心皮中表達(dá)量最低。

在日本裂葉牽牛、矮牽牛和非洲菊中，同一器官僅有一個(gè)DFR基因表達(dá)，其表達(dá)模式十分復(fù)雜[11]。矮牽牛中雖有3個(gè)DFR基因拷貝（DFRA，DFRB，DFRC），但只有DFRA在花器官中表達(dá)[32]；日本裂葉牽牛中也有3個(gè)DFR基因拷貝（DFRA，DFRB，DFRC），但僅在DFRB突變發(fā)生時(shí)會(huì)抑制花中的色素合成途徑[33]；同時(shí)Southern雜交分析表明非洲菊存在多個(gè)DFR基因拷貝，但僅GDFR1有催化活性并在花中表達(dá)，對(duì)其啟動(dòng)子分析表明，它的表達(dá)受復(fù)雜的調(diào)控[34]。百脈根(Lotus japonicus)的基因組中有5個(gè)DFR基因,并能產(chǎn)生6個(gè)具有功能的mRNA，具有不同的組織特異性 [5]，其DFR1在花、豆莢、莖、根、葉和結(jié)節(jié)中都表達(dá)；DFR2則在除葉以外的其它器官表達(dá)；DFR3只在葉和莖中表達(dá)；DFR4和DFR5不在結(jié)節(jié)中表達(dá)外，且在根中表達(dá)較弱[35]。

4.2影響表達(dá)的因素

影響DFR基因表達(dá)的因素很多，包括環(huán)境因子對(duì)的影響，外源化學(xué)物質(zhì)對(duì)的影響等等。DFR和CHS都是光調(diào)節(jié)酶，光的誘導(dǎo)可以提高這些酶的活性，從而促進(jìn)花色素苷的積累[36]。矮牽牛花在暗培養(yǎng)下的幼蕾期，花色素苷的積累以及CHS和DFR基因的表達(dá)均受到明顯的限制，隨著光強(qiáng)度的增加，花色素苷的積累和相關(guān)基因的表達(dá)即受到促進(jìn)[37]。溫度對(duì)DFR基因的轉(zhuǎn)錄也有一定的影響，張學(xué)英等[38]指出39/18 ℃(晝/夜)處理玫瑰花3 d，花色素苷含量明顯呈下降趨勢(shì)，CHS和DFR基因轉(zhuǎn)錄水平也有所下降。Hasegawa[39]研究了低溫誘導(dǎo)下水芹花青素積累及相關(guān)基因的表達(dá)，表明DFR基因表達(dá)特異地受低溫的影響，DFR與PAL和CHS表達(dá)機(jī)制都不同，在低溫脅迫中DFR的表達(dá)為關(guān)鍵的一步。pH值也影響著DFR的表達(dá)，如在矮牽牛中，bHLH類轉(zhuǎn)錄因子ANI的突變導(dǎo)致了細(xì)胞液泡的pH值升高，并影響了DFR基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制了花色素普的合成[40]。

外源化學(xué)物質(zhì)對(duì)的影響體現(xiàn)在蔗糖還可以提高DFR和ANS酶的活性[41]。在低Ca2+濃度下DFR基因的表達(dá)量不高，隨著Ca2+濃度的增加DFR基因的表達(dá)量也隨之升高[42]。

5DFR基因在花色改良上的應(yīng)用

世界上第一例通過基因工程技術(shù)改變花色的實(shí)例是在1987年，Meyer等[43]將玉米DFR的基因?qū)氚珷颗c01突變體，其花色由白色變?yōu)榈u紅色。之后，荷蘭S&G種子公司將玉米的DFR基因?qū)肓税珷颗?再將轉(zhuǎn)基因植株自交,培育出了橙色矮牽牛[44]。Tanaka等[45]把從玫瑰花瓣中克隆的DFR基因，轉(zhuǎn)入淡粉紅色的矮牽牛中，產(chǎn)生了矮牽牛所缺乏的橙紅色的花葵素。Johnson等[14]在研究蘭屬植物的花時(shí)，將蘭屬DFR基因轉(zhuǎn)入矮牽牛品系中，結(jié)果表明蘭屬的DFR不能有效還原DHK，從而導(dǎo)致花葵素的缺乏。

由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能的研究領(lǐng)域，同時(shí)作為一種有效修飾花色的新方法被應(yīng)用到了觀賞植物的呈色調(diào)控中[46]。孫穎等[47]在夏瑾上引入反義DFR基因誘導(dǎo)黃酮累積，因?yàn)楣诧@色效應(yīng)而產(chǎn)生了藍(lán)色花卉。2000年，Meyer等[48]將反義DFR基因?qū)胨{(lán)豬耳中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系的花冠花色素苷含量均有減少，產(chǎn)生了多種新花色圖案，且冠檐中的花色素含量的減少程度比冠筒大，由于轉(zhuǎn)化植株中DFR基因的鈍化，造成了大量黃酮和黃酮醇物質(zhì)的積累，致使藍(lán)豬耳的花色顯得更藍(lán)。One等[49]揭示了通過調(diào)控橙酮生物合成途徑導(dǎo)致夏瑾產(chǎn)生黃花。抑制內(nèi)源F3′H或DFR基因，過表達(dá)金魚草C4′GT（查爾酮4′－O－葡糖基轉(zhuǎn)移酶）基因引起金色草素6－O－葡萄糖苷在花瓣上的大量積累。在藍(lán)眼菊的研究中，通過RNAi抑制F3′H并且導(dǎo)入非洲菊DFR基因，也獲得了天竺葵色素積累的結(jié)果[50]。

此外，通過控制羥基化模式，能表達(dá)翠雀素型花青素的轉(zhuǎn)基因康乃馨和玫瑰也獲得成功，已被商業(yè)化生產(chǎn)[51-52]。導(dǎo)入外源DFR和F3′5′H基因也是產(chǎn)生翠雀素的前提條件。目前在日本商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因藍(lán)色玫瑰含有外源DFR基因，并且同時(shí)過表達(dá)三色堇F3′5′H和夏瑾花青素5－?；D(zhuǎn)移酶基因。近年來，導(dǎo)入翠雀素的紫羅蘭和菊花等品種也陸續(xù)問世[47]。澳大利亞Florigene公司和日本Sandory公司的研究人員將矮牽牛F3′ 5′ H和DFR基因?qū)肴狈FR的白色香石竹，培育出紫色品種“Moon-dust”，現(xiàn)已在2個(gè)國(guó)家銷售，成為第一例上市的轉(zhuǎn)基因花卉[53]。

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