張衛(wèi)華 ，張維新，劉華東，石富國(guó)，陳志明 ，劉 舟

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210046；2.寧夏中衛(wèi)市人民醫(yī)院，寧夏中衛(wèi)755000；3.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇南京211198）

糖尿病腦病是近幾年受到研究者重視的糖尿病慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，表現(xiàn)為癡呆樣的學(xué)習(xí)和記憶功能障礙［1］。盡管糖尿病腦病的發(fā)病機(jī)制目前還沒有完全明確，但研究表明，神經(jīng)細(xì)胞的變性、凋亡導(dǎo)致中樞神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目減少是發(fā)生認(rèn)知功能障礙的重要病理基礎(chǔ)［2］。黃連溫膽湯出自清代陸廷珍《六因條辨》，由黃連、半夏、陳皮、茯苓、枳實(shí)、竹茹、炙甘草、生姜組成，具有清化痰熱之功，可用于治療痰熱內(nèi)擾所致的糖尿病并發(fā)癥［3］，但應(yīng)用于糖尿病腦病卻少見報(bào)道。本研究通過(guò)黃連溫膽湯干預(yù)治療2型糖尿病小鼠后，原位末端標(biāo)記法（TUNEL法）檢測(cè)海馬神經(jīng)元的凋亡，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)caspase-3蛋白的表達(dá)，以期探討黃連溫膽湯對(duì)2型糖尿病小鼠海馬神經(jīng)凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.3 儀器與設(shè)備 酶標(biāo)儀（Thermo，美國(guó)）；電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；大容量低溫離心機(jī)（KUBOTA，日本）；96孔培養(yǎng)板（Costar，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模與給藥 小鼠按體重隨機(jī)分為空白組（10只）和造模組，分別喂養(yǎng)普通飼料和高糖高脂飼料。喂養(yǎng)4 w后，造模組小鼠腹腔注射STZ 100 mg/kg，保證所有注射在15 min內(nèi)完成。注射72 h后，禁食不禁水12 h，采用葡萄糖氧化酶法測(cè)量小鼠空腹血糖，空腹血糖值>11 mmol/L者為2型糖尿病小鼠，去除血糖值不達(dá)標(biāo)小鼠，按照血糖值隨機(jī)分為二甲雙胍組（0.25 g/kg）、模型組、黃連溫膽湯低劑量組（5 g/kg）、中劑量組（10 g/kg）和高劑量組（20 g/kg），每組 10只。造模成功后各給藥組連續(xù)灌胃給藥3 w，空白組和模型組給予等體積蒸餾水。

1.2.2 TUNEL法檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)caspase-3表達(dá) 各組取5只小鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后，開胸暴露心臟，經(jīng)左心室插管，同時(shí)剪開右心耳，快速灌注4℃保存的生理鹽水，至肝臟變白后，改灌注10%中性甲醛固定液，固定至小鼠全身僵直，切取腦組織后部分，置于4%多聚甲醛固定液24 h。進(jìn)行石臘包埋后，將石蠟組織切片，按TUNEL、caspase-3試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色。各切片在400×光鏡視野下隨機(jī)選取3個(gè)不重疊區(qū)域，計(jì)算TUNEL、caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用單向方差分析法（ANOVA）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

TUNEL和caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)，結(jié)果見圖1、圖2、表 1。

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)ICR小鼠，4 w齡，體重18 g～22g，江蘇省南京市青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2007-0001。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，保持12 h晝夜節(jié)律，室溫（22±1）℃，自由飲水?dāng)z食。

1.1.2 藥物與試劑 二甲雙胍購(gòu)自上海醫(yī)藥（集團(tuán)）有限公司信宜制藥廠；鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)自美國(guó)sigma公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒購(gòu)于上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；TUNEL、caspase-3檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；其余試劑均為分析純。黃連溫膽湯組成藥物均購(gòu)于南京先聲藥店丁家橋店，并經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)中藥資源開發(fā)教研室秦民堅(jiān)教授鑒定。藥物浸泡30 min后，加8倍量的雙蒸水，從煮沸起計(jì)時(shí)1 h。倒出藥液后，重復(fù)加4倍水煎煮0.5 h兩次。藥液用8層紗布過(guò)濾2次，60℃水浴旋蒸至濃度為2g/mL（按生藥量計(jì)算），4℃保存。飼料：高糖、高脂、高熱量飼料的配方∶蔗糖∶豬油∶奶粉∶雞蛋∶豬膽酸鹽∶普通飼料粉=30∶20∶4∶2∶0.05∶63，由江蘇省南京市青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供。

圖1 各組小鼠海馬區(qū)TUNEL染色結(jié)果（400×）

圖2 各組小鼠海馬區(qū)caspase-3的表達(dá)（400×）

由圖1～圖2可見，海馬神經(jīng)組織TUNEL染色后陽(yáng)性細(xì)胞呈棕褐色，免疫組織化學(xué)法處理caspase-3后陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色。由表1可以看出，與空白組比較，模型組小鼠海馬TUNEL與caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多（P<0.01）；與模型組比較，黃連溫膽湯中、高劑量組及二甲雙胍組小鼠海馬TUNEL與caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著降低（P<0.01）。

表1 黃連溫膽湯對(duì)小鼠海馬神經(jīng)凋亡細(xì)胞和caspase-3表達(dá)的影響 （±s）

表1 黃連溫膽湯對(duì)小鼠海馬神經(jīng)凋亡細(xì)胞和caspase-3表達(dá)的影響 （±s）

注：與空白組比較，1）P<0.01；與模型組比較，2）P<0.01

組別 n TUNEL（個(gè)） caspase-3（個(gè)）空白組 15 10.75±2.66 11.05±3.14模型組 15 38.63±10.991） 61.86±21.571）二甲雙胍組 15 17.88±4.692） 21.97±8.892）黃連溫膽湯低劑量組 15 32.50±8.84 43.64±15.88黃連溫膽湯中劑量組 15 15.25±5.402） 24.76±7.292）黃連溫膽湯高劑量組 15 14.13±5.122） 18.31±5.322）

3 討論

糖尿病腦病是糖尿病最為常見的慢性并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為慢性進(jìn)行性的認(rèn)知功能障礙，尤其是學(xué)習(xí)和記憶能力的降低［4-5］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中海馬是與學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知有關(guān)的重要結(jié)構(gòu)，海馬區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的變性、凋亡與其功能障礙有關(guān)［6］。本課題在研究中發(fā)現(xiàn)黃連溫膽湯可以顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖（FBG）［7］，也可明顯提高糖尿病小鼠的學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知能力［8］。

細(xì)胞凋亡的主要檢測(cè)技術(shù)包括形態(tài)學(xué)方法（如光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡和流式細(xì)胞儀）、生物化學(xué)方法（如DNA ladder）和分子生物學(xué)方法（如 TUNEL 法）［7］。TUNEL 法是目前最常用的組織樣品凋亡細(xì)胞的檢測(cè)手段，但由于該法對(duì)能否區(qū)分凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞尚存爭(zhēng)議，即可能存在假陽(yáng)性的缺點(diǎn)。因此，多數(shù)學(xué)者采用TUNEL法與相關(guān)基因表達(dá)同步測(cè)定相結(jié)合的方法進(jìn)行研究。目前認(rèn)為caspase是一切凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路，在caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中caspase-3被認(rèn)為是caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的終末剪切酶，一旦被激活，凋亡常難以避免，該酶是否被激活也是鑒別細(xì)胞凋亡與壞死的主要依據(jù)［9］。因此，本研究在使用TUNEL法檢測(cè)腦組織凋亡細(xì)胞的基礎(chǔ)上，同步進(jìn)行caspase-3基因表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)，一方面克服單純TUNEL法可能出現(xiàn)假陽(yáng)性的缺點(diǎn)，另一方面能更深入研究細(xì)胞凋亡的作用機(jī)理。研究結(jié)果顯示，黃連溫膽湯能顯著抑制海馬神經(jīng)凋亡，減少caspase-3蛋白的表達(dá)，說(shuō)明黃連溫膽湯參與了依賴于casepase-3蛋白的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)。

總之，黃連溫膽湯能顯著改善2型糖尿病小鼠的認(rèn)知功能，其機(jī)制可能是通過(guò)減少caspase-3蛋白的表達(dá)，從而抑制海馬神經(jīng)凋亡。由于糖尿病腦病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，中藥復(fù)方多成分多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，黃連溫膽湯治療糖尿病腦病的具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

［1］Sima A A.Diabetes underlies common neurological disorders［J］.Ann Neurol，2004，56（4）：459-461.

［2］張紅.糖尿病腦病研究進(jìn)展［J］.臨床薈萃，2003，18（8）：478-47.

［3］王永山.溫膽湯治療糖尿病并發(fā)癥芻議［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11（4）：158-160.

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［6］Savitz S I，Rosenbaum D M.Apoptosis in neurological disease［J］.Neurosurgery，1998，42（3）：555-574.

［7］張衛(wèi)華，劉華東，劉舟，等.黃連溫膽湯對(duì)2型糖尿病小鼠血糖的影響［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13（8）：118-119.

［8］張衛(wèi)華，劉舟，石富國(guó)，等.黃連溫膽湯對(duì)2型糖尿病小鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的影響［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（4）：948-949.

［9］傅桂蓮.分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：201-213.