王洪海，張成博，韓 濤，楊海燕，于學美

（1.山東中醫(yī)藥大學，山東濟南250355；2.泰山醫(yī)學院，山東泰安271016）

酒精性脂肪肝是酒精性肝病最早的病理改變之一，也是飲酒所致的最常見的肝臟病變。與其他類型脂肪肝相比，酒精性脂肪肝發(fā)生肝纖維化和肝硬化的進程相對較快，發(fā)病率相對較高。早期治療酒精性脂肪肝可以降低酒精性肝硬化的發(fā)病率，中醫(yī)通過辨證施治具有獨特的療效。我們用臨床治療經(jīng)驗方芪龍益肝方藥作用于酒精性脂肪肝大鼠，檢測其對模型大鼠肝組織細胞色素CYP2E1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠50只，體重（180±20）g。由山東大學實驗動物中心提供（SCXK魯20050004）。

1.1.2 主要試劑和儀器 HP2AS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)，CYP2E1多抗購自美國CHEMICON公司（批號：20050603）。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠酒精性脂肪肝模型建立 雄性Wistar大鼠50只，隨機取10只作為正常對照組正常飼養(yǎng)，其余動物按照文獻方法［1-3］造模，給予基礎飼料加1%膽固醇、5%豬油、10%玉米油做成的混合飼料，另外按白酒劑量5 g/kg·次灌胃，以后每10 d根據(jù)大鼠體重、活動及反應情況增加灌酒量 1 g，最終白酒灌胃劑量達8 g/kg·次［4］。飼養(yǎng)8 w后，空白對照組、模型組隨機各取5只采血測定CHO、TG、HDL、ALT、AST，活殺做病理組織學檢查確定是否已形成酒精性脂肪肝模型。

1.2.2 分組及給藥 隨機將酒精性脂肪肝模型大鼠分為模型對照組、護肝片組、聯(lián)苯雙酯組、全方組。芪龍益肝方藥由山東中醫(yī)藥大學藥學院制劑中心提供，全方成人日用量為117 g，按體表面積比值折算，給予大鼠中劑量10.3 g/kg。護肝片由黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：200408004。人日用量為12片，按體表面積折算，護肝片組大鼠給藥中劑量為1.08片/kg。聯(lián)苯雙酯滴丸由德州德藥有限公司生產(chǎn)，批號：040415。按體表面積折算，聯(lián)苯雙酯組大鼠給藥的中劑量為4.05 mg/kg。以上藥物按1 mL/100 g體重的體積每日早上8時灌胃給藥，連續(xù)30 d。正常對照組、模型對照組灌胃等量生理鹽水。除正常對照組外，其他各組繼續(xù)給予高脂飼料喂食，同時給予含乙醇10%的日常飲用水。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS13.0 for Windows統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 大鼠酒精性脂肪肝模型建立

結果見表1，圖1。

表1 大鼠酒精性脂肪肝模型檢測 （mmol/L，±s）

表1 大鼠酒精性脂肪肝模型檢測 （mmol/L，±s）

注：與正常對照組比較，1）P<0.001，2）P<0.05

組別 T G C H O H D L A L T A S T正常對照組 0.75±0.14 1.16±0.33 1.09±0.15 46.75±8.2492.25±5.56模型組 2.25±0.40 1） 2.30±0.38 2） 0.76±0.14 1） 81.5±8.13 1） 174.75±10.27 1）

由表1可以看出，模型組 TG、CHO、ALT、AST明顯增高，HDL下降，與正常對照組相比較差異均有統(tǒng)計學意義，提示模型成立。

圖1 成模檢測兩組大鼠肝組織病理切片（HE染色）

由圖1可以看出，正常對照組肝細胞大小一致，排列整齊，核無畸形，無明顯變性、壞死和纖維化。模型對照組肝細胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)有大量脂肪空泡，細胞核變小，并且偏位。與正常對照組比較，模型對照組出現(xiàn)明顯的脂肪變性。

2.2 芪龍益肝方對肝組織細胞色素CYP2E1表達的影響

末次給藥后24 h，處死取各組大鼠肝組織，經(jīng)10%中性福爾馬林充分固定，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片，作細胞色素p-4502E1（CYP2E1）染色。采用SABC法，切片脫蠟水化后經(jīng)微波抗原修復，血清封閉，滴加1∶200兔抗鼠P-4502E1多抗。4℃冰箱過夜，DAB顯色。染色過程中作陰性對照和陽性對照，陰性對照以PBS緩沖液替代一抗。將P-4502E1免疫組織化學染色切片在10倍的物鏡下，選擇陽性細胞較多的區(qū)域采集3～5個光鏡視野，輸入HP2AS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)。統(tǒng)一背底和倍體，對陽性細胞占所有細胞的百分比均值進行計算機定量分析。結果表明，酒精性脂肪肝時CYP2E1表達增強。給予芪龍益肝方后CYP2E1表達減少，與護肝片組和聯(lián)苯雙酯組比較差異有統(tǒng)計學意義，結果見表2。

表2 芪龍益肝方對肝組織細胞色素CYP2E1表達的影響 （±s）

表2 芪龍益肝方對肝組織細胞色素CYP2E1表達的影響 （±s）

注：與模型對照組比較，1）P<0.001；與正常對照組比較，2）P<0.01，3）P<0.05；與護肝片組比較，4）P<0.05；與聯(lián)苯雙酯組比較，5）P<0.05

組別 C Y P 2 E 1表達正常對照組 0.031±0.01模型對照組 0.380±0.14 2）全方組 0.080±0.05 1）4）5）拆方組 0.150±0.07 1）3）護肝片組 0.170±0.05 1）聯(lián)苯雙酯組 0.180±0.10 1）

3 討論

芪龍益肝方就是在肝氣虛損、酒毒損傷的理論基礎上組方，本方由生黃芪、穿山龍、玫瑰花、葛根、白術、青皮等藥物組成。生黃芪甘溫，入肺、脾經(jīng)。功能補氣，兼能升氣?！夺t(yī)學衷中參西錄》載“肝屬木而應春氣，其氣溫而性喜條達，黃芪之性溫而上升，以之補肝緣同氣相求之妙用”?，F(xiàn)代藥理研究證明黃芪具有保肝、抗氧化、抗肝纖維化、降脂的作用。穿山龍活血逐瘀，具有降低膽固醇、抗炎鎮(zhèn)痛功效。葛根輕清升散，能升發(fā)脾之清氣，鼓舞胃氣上行。脾胃是氣機升降之樞紐，能升清降濁，清陽升則濁陰自降，用葛根以升發(fā)清陽、解酒毒。白術健脾燥濕，以助脾運，培土榮木以加強黃芪補肝氣之力，現(xiàn)代藥理表明白術具有保肝、降酶、利膽、抗氧化、改善免疫的作用。玫瑰花理氣解郁、和血散瘀，玫瑰花、穿山龍兩藥皆氣味芳香，有化濁之功，以通肝絡解疼痛。青皮苦辛性溫，入肝、膽經(jīng)。本品沉降下行，能疏肝行氣，善理肝膽之滯氣，尤善除痞散結、消積化滯。用其直入肝經(jīng)，疏肝破氣以消除積滯。諸藥合用，共收補益肝氣、化濁通絡之功。

細胞色素P-450系統(tǒng)是位于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一組混合功能氧化酶系，它參與內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)代謝，細胞色素P-4502E1（CYP2E1）是該系統(tǒng)的主要組成部分，CYP2E1是機體攝入藥物和毒物（四氯化碳、乙醇、脂肪酸）的主要代謝酶。從解毒功能的角度來看，CYP2E1比其他同工酶更為重要［5］。CYP2E1在酒精性肝病的發(fā)病機制中主要參與脂質(zhì)過氧化反應，與氧自由基和羥自由基的生成有關。酒精在肝細胞內(nèi)通過細胞色素P4502E1并在鐵離子參與下的氧化作用，會產(chǎn)生過多的氧應激產(chǎn)物，如羥自由基、超氧陰離子、過氧化氫等自由基，這些自由基可激活磷脂酶及脂質(zhì)過氧化反應，降低膜磷脂，改變其通透性和流動性，從而改變與膜結合的酶、受體和離子通道的微環(huán)境，影響其功能；還可以刺激肝星狀細胞分泌膠原，最終導致肝纖維化的產(chǎn)生［6］。CYP2E1隨脂肪肝程度的加重，表達逐漸增高［7］。酒精性脂肪肝時CYP2E1表達增強。正常肝組織內(nèi)，CYP2E1表達僅見于中央靜脈區(qū)，主要表達于肝腺泡Ⅲ區(qū)，在乙醇、藥物或其他毒物的作用下Ⅰ區(qū)或Ⅱ區(qū)CYP2E1表達。給予芪龍益肝方后CYP2E1表達減少，與護肝片組和聯(lián)苯雙酯組比較差異有統(tǒng)計學意義。抑制CYP2E1在Ⅰ區(qū)或Ⅱ區(qū)的表達可能是芪龍益肝方治療酒精性脂肪肝的作用機制之一。

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