楊 清，李大光，陳 勃，張靈敏，劉 洋，柳忠輝

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部輸血科，吉林 長春 130031；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，吉林 長春 130021)

激活素A(activin，ACTA)屬于TGF-β超家族成員,在初期胚胎形成、神經(jīng)分化誘導(dǎo)、造血細(xì)胞增殖和分化、內(nèi)分泌中樞垂體性激素分泌等多方面發(fā)揮重要作用。ACTA可由巨噬細(xì)胞、Th2細(xì)胞以及肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。有研究[1-2]表明：細(xì)胞因子在肝纖維化發(fā)病機(jī)制中具有重要作用，而激活素是新近發(fā)現(xiàn)參與肝纖維化形成的細(xì)胞因子，其中以ACTA最為重要，其以自分泌、旁分泌的形式作用于肝細(xì)胞，導(dǎo)致肝細(xì)胞增殖抑制、誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)分泌等，參與肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程。卵泡抑素(follistain，F(xiàn)S)具有廣泛的組織分布且與激活素具有高親和力，作為激活素結(jié)合蛋白，具有阻斷激活素與其受體結(jié)合、中和激活素等多方面的生物學(xué)活性[3-4]。目前，關(guān)于ACTA和FS在酒精性肝病中的作用，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本文作者擬通過探討ACTA和FS在酒精性肝損傷中的作用，進(jìn)一步闡明酒精性肝病的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及模型建立C57雄性小鼠80只，體質(zhì)量18～22 g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為模型組(n=40)和對照組(n=40)。采用酒精灌胃方法制造酒精性肝損傷小鼠模型。選用酒精為北京牛欄山56℃二鍋頭，每日1次按每只小鼠5 g·kg-1酒精量給予。連續(xù)灌胃3 d。對照組小鼠選用蒸餾水連續(xù)灌胃3 d。

1.2 指標(biāo)檢測選擇小鼠灌胃后24、72、120及168 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別殺死模型組和對照組小鼠各10只，采集全部血液，37℃水浴30 min，2 000 r·min-1離心15 min，取血清-80℃凍存。其肝組織采用預(yù)冷的PBS液100 mL按心臟灌流方法進(jìn)行清洗，取肝臟在4%多聚甲醛中固定過夜，石蠟切片及抗ACTA及FS染色。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色染色為陽性細(xì)胞，無明顯染色細(xì)胞為陰性。采用ELISA法檢測小鼠血清ACTA和FS水平，試劑由武漢博生生物公司提供。采用改良賴氏法測定模型鼠和對照鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平變化，試劑由武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司提供，嚴(yán)格按說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1 2組小鼠血清ALT、AST、ACTA和FS水平變化各時(shí)間點(diǎn)對照組小鼠血清ALT、AST和ACTA水平無明顯變化，而模型組小鼠血清ALT、AST和ACTA水平均有不同程度的變化，其中ALT、AST以24 h為最高，ACTA以72 h為最高。模型組小鼠血清ALT、AST和ACTA水平在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)與相應(yīng)對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，模型組和對照組小鼠血清FS水平變化無明顯差別，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 HE染色結(jié)果對照組小鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞大小均勻、排列整齊，無變性壞死，無淋巴細(xì)胞浸潤。模型組小鼠末次酒精灌胃后24 h時(shí)，肝臟可見明顯的點(diǎn)狀出血壞死，壞死處可見大量的中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤，局部肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松；肝組織病變尤以120 h時(shí)最為嚴(yán)重，結(jié)構(gòu)紊亂，肝小葉內(nèi)細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)淡染疏松，呈氣球樣變。見圖1(插頁一)。

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果對照組小鼠肝組織中幾乎不表達(dá)ACTA，而FS表達(dá)陽性。模型組小鼠肝組織中ACTA陽性顆粒分布主要位于中央小葉和門靜脈周圍肝細(xì)胞中，并在間質(zhì)細(xì)胞質(zhì)及其周圍也可見其表達(dá)。FS在模型組小鼠肝組織表達(dá)與對照組比較無明顯差異。見圖2～4(插頁二)。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠血清中ALT、AST、ACTA 及 FS水平的變化

3 討 論

激活素是在性腺中發(fā)現(xiàn)的雙鏈糖蛋白，屬于TGF-β超家族成員。大量研究[5-6]證實(shí)：激活素是多功能的生長與分化調(diào)控因子，與肝臟疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān)。目前研究最多的是ACTA，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞(HSC)均能產(chǎn)生ACTA，以自分泌，旁分泌的方式作用于自身和周圍細(xì)胞，參肝細(xì)胞活性調(diào)節(jié)，與肝臟疾病形成關(guān)系最為密切。FS又稱卵泡休止素，是1987年先后從豬和牛的卵泡液中分離獲得的一種新的單鏈糖蛋白，F(xiàn)S具有廣泛的組織分布且與激活素具有高親和力，作為激活素結(jié)合蛋白，具有阻斷激活素與其受體結(jié)合、中和激活素等多方面的生物學(xué)活性。FS作為一種天然拮抗劑參與多種生理、病理功能的調(diào)節(jié)，在肝纖維化、肺纖維化、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的形成中均具有重要的作用[7-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：正常小鼠肝臟組織低水平表達(dá)ACTA和FS，且主要位于肝小葉內(nèi)門脈區(qū)的肝細(xì)胞，在肝損傷過程中ACTA表達(dá)升高明顯，而且在肝細(xì)胞損傷區(qū)域周圍表達(dá)最為明顯，F(xiàn)S在小鼠肝損傷后無明顯變化。因此，在酒精性肝纖維化形成過程中ACTA和FS表達(dá)發(fā)生了不同的變化。本研究結(jié)果顯示：酒精性肝損傷時(shí)ACTA表達(dá)明顯增高，在第7天(168 h)時(shí)，ACTA水平明顯下降，但依然明顯高于對照組；模型組小鼠血清ALT和AST水平在各時(shí)間點(diǎn)均明顯高于相應(yīng)對照組，以24 h時(shí)最高，提示 ACTA水平變化與肝損傷程度相一致。但模型組小鼠血清ALT和AST水平從120 h后又有所升高，這可能與模型鼠肝臟組織免疫反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)，尚待探討。有研究表明：ACTA可能通過抑制肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增生，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)而參與肝纖維化、肝硬變的形成，F(xiàn)S與激活素結(jié)合而阻斷激活素生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮,激活素與FS系統(tǒng)調(diào)節(jié)了肝細(xì)胞的正常生長，激活素具有抑制作用，F(xiàn)S通過阻斷激活素而發(fā)揮促進(jìn)作用，這種系統(tǒng)的異常影響細(xì)胞正常生長，如肝腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞，這些細(xì)胞具有無限制生長特性，在這些細(xì)胞中常伴有激活素-FS系統(tǒng)改變。在肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG-2中的研究證實(shí)：這些細(xì)胞有激活素受體表達(dá)異常，表現(xiàn)為受體類型減少及與激活素親和力下降，相反FS的分泌無影響[10-14]。本實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠FS水平似乎略有升高跡象，是否可考慮為FS對ACTA活性增強(qiáng)的抑制性反應(yīng)，尚需進(jìn)一步深入研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：ACTA在酒精性肝損傷過程中起重要作用，激活素-FS系統(tǒng)失衡可能是酒精性肝病、肝纖維化形成的重要原因。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Phillips DJ,De Kretser DM,Hedger MP.Activin and related proteins in inflammation: not just interested by standers[J].Cytokine Growth Factor Rev,2009,20(2)：153-164.

[2]Wang SY,Tai GX,Zhang PY，et al.Inhibitory effect of activin A on activation of lipopolysaccharide-stimulated mouse macrophage RAW264.7 cells[J].Cytokine,2008,42(1): 85-91.

[3]Zhang HJ，Tai GX，Zhou J,et al.Regulation of activin receptor-interacting protein 2 expression in mouse hepatoma Hepa1-6 cells and its relationship with collagentype Ⅳ[J].World J Gastroenterol，2007，13(41)：5501-5505.

[4]Yndestad A，Haukeland JW，Dahl TB,et al.A complex role of Activin A in non-alcoholic fatty liver disease[J].Am J Gastroenterol，2009，104(9)：2196-2205.

[5]張紅軍，臺桂香，柳忠輝.激活素在肝纖維化形成中的作用[J].臨床肝膽病雜志，2007，11(3)：232-234.

[6]張紅軍，柳忠輝，馬 迪，等.激活素A及其ⅡA型受體在小鼠肝損傷模型肝組織中的表達(dá)[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2008,34(3):393-396.

[7]陳芳芳，馮 野，王軼楠，等.激活素A對巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞吞噬活性及TLR4表達(dá)的雙向調(diào)節(jié)作用[J].中國生物制品學(xué)雜志，2009,22(6):560-562.

[8]方 琳，劉海巖，崔雪玲，等.抗激活素受體相互作用蛋白 1抗體的制備及應(yīng)用[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2008,34(1):11-13.

[9]陳 曦，李 斌.激活素和抑制素與卵巢腫瘤的研究進(jìn)展[J].國際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2011，38(5)：423-425.

[10]陳玲琴，湯曾耀，金 萱.表皮生長因子對卵巢激活素基因表達(dá)的調(diào)節(jié)及其信號通路[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，34(1)：134-136.

[11]陳 穎，徐 苓.激活素-抑制素-卵泡抑素系統(tǒng)研究進(jìn)展[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2007，32(4)：168-170.

[12]孔祥民，劉忠艷，傅春彬，等.慢性乙肝患者血清ACTA水平及臨床評價(jià)[J].臨床消化雜志，2009，25(3)：188-189.

[13]于 昉，王軼楠，李 楠，等.肝硬化患者外周血及肝組織激活素A水平變化[J].中國老年學(xué)雜志，2010，35(22)：332-333.

[14]李 楠，柳忠輝，霍德勝，等.激活素A誘導(dǎo)小鼠Ⅱ型巨噬細(xì)胞活化[J].中國免疫學(xué)雜志，2010，26(9)：771-773.