陳福順，王 卓，王湘慶，郎森陽

(解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100853)

癲癇是由大腦神經(jīng)元異常放電導致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常的腦部疾病，具有突然發(fā)生、反復發(fā)作的特點。目前的抗癲癇藥物大多通過降低神經(jīng)元興奮性或增加抑制性神經(jīng)遞質(zhì)起作用。γ-氨基丁酸(GABA)是中樞內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，多年來癲癇的發(fā)生被認為是中樞內(nèi)GABA抑制作用減弱或缺乏的結果。orexin又稱hypocretin，因其首先于1998年在下丘腦發(fā)現(xiàn)，并與食欲有關，故命名為食欲素，包括orexin-A和orexin-B(又稱為食欲素A型和食欲素B型)，均為orexin前體的分解產(chǎn)物[1-2]，其受體共有2種亞型—orexin1R及orexin2R，廣泛分布于整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)[1-5]，此后又發(fā)現(xiàn)其與交感神經(jīng)活動[6]以及睡眠和覺醒狀態(tài)的調(diào)控有關[7-8]，而對于其與癲癇的有關研究，有實驗[9]證實orexin能增強GABA電流，也有報道[10]認為反復癲癇發(fā)作患者腰穿腦脊液中orexin-A濃度少于非癲癇患者，但有關orexin-B的研究尚未見報道。因此，orexin可能與癲癇的發(fā)生或控制有關。目前對于orexin-B在癲癇發(fā)作后多時間點變化的研究國內(nèi)外均未見報道，因此本研究采用海人酸(kainic acid，KA)腹腔注射誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作，用免疫組化方法檢測orexin-B及其神經(jīng)纖維在不同時間點的變化情況，以闡明orexin-B在癲癇發(fā)生中的變化，深化癲癇的發(fā)病機制，且為癲癇治療開拓一個新的領域。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要儀器和試劑成年雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量250～300 g，由解放軍總醫(yī)院動物中心提供。冰凍切片機為Lei CA CM1900，Olympus BX53顯微鏡，KA(編號KA0250)購自Sigma公司，羊抗orexin-B多克隆抗體(編號SC-8071)為Santa Cruz公司產(chǎn)品，超敏即用型二步法(非生物素)檢測試劑盒(編號PV-9003)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 實驗動物分組及模型制作本實驗符合衛(wèi)生部實驗動物使用與管理指導意見和解放軍總醫(yī)院實驗倫理委員會的有關規(guī)定。實驗大鼠分籠飼養(yǎng)，飼料與水充足供應，自由攝取。動物房室溫22℃，濕度20%～30%，12 h-12 h明暗交替。先飼養(yǎng)適應1周后，按動物體重大小編號，隨機分為6組，每組5只：①經(jīng)腹腔注射KA誘發(fā)急性癲癇發(fā)作后的時間點，按第8小時、1、3、7天，分別分為8 h、1 d、3 d和7 d組；②慢性復發(fā)型組為腹腔注射KA誘發(fā)癲癇發(fā)作之后第7天再用KA(4 mg·kg-1)注射誘發(fā)癲癇發(fā)作；③正常對照組，腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 動物行為學觀察及癲癇變化強度分級大鼠經(jīng)腹腔注射KA后，觀察其行為學變化，按Racine描述的5級標準進行判斷并詳細記錄：1級，閉眼、豎毛，胡須抖動，嗅、面部抽搐；2級，點頭運動、咀嚼運動、沿著面部肌肉痙攣；3級，一側(cè)前肢抬起，輕微陣攣；4級，用后肢站起，伴有兩側(cè)前肢的陣攣；5級，站立、雙側(cè)前肢陣攣加重，失去平衡跌倒伴全身陣攣[11]。

1.4 動物處死及標本制備大鼠于致癇發(fā)作后的8 h、1 d、3 d、7 d、慢性復發(fā)相應時間點，以2%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)將大鼠麻醉后，經(jīng)左心室刺入升主動脈，剪開右心耳，先快速灌注冷PBS 200 mL后，再灌注4%多聚甲醛 0.1 mol、 PBS (pH 7.4,4℃) 250 mL，開顱取腦,固定于上述灌注液中,然后經(jīng)含15%、20%，30%蔗糖的PBS溶液先后梯度脫水沉底,待腦組織沉底后，取腦組織修塊，根據(jù)Paxinos大鼠圖譜定位神經(jīng)核團[12]，自對耳線10.70 mm處開始至對耳線2.7 mm止的范圍內(nèi)于冰凍切片機上行厚度為30 μm的冠狀位連續(xù)切片。分別將切片置于24孔中，每孔為連續(xù)的10張，并用凍存液-20℃保護切片。

1.5 orexin-B細胞及其神經(jīng)纖維的免疫組織化學染色每只動物選取4片切片，選取部位為對耳線5.7～6.7 mm范圍內(nèi)的連續(xù)4孔，每孔各取1片。用羊抗鼠多克隆抗體檢測orexin-B及其神經(jīng)纖維在大鼠腦片的表達。具體如下：①EDTA，95℃、15 min，PBST洗片，3 min×3次；②3%H2O2去離子水孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBST洗片，3 min×3次；③滴加10%兔血清，孵育1 h；④滴加一抗羊抗鼠多克隆抗體(1∶1 000，Santa Cruz)，4℃過夜；⑤棄去一抗，PBS洗片,3 min×3次；⑥滴加PV-9003試劑盒Polymer Helper，室溫孵育20 min，PBS洗片,3 min×3次；⑦滴加PV-9003試劑盒Poly-HRP anti-Goat IgG，室溫孵育20 min，PBS洗片,3 min×3次；⑧DAB顯色1 min，終止反應；⑨裱片，自然晾干后，依次脫水透化，中性樹膠封片。鏡下觀察陽性表達部位呈棕黃色。

1.6 圖像處理利用圖像分析系統(tǒng)對每張免疫組織化學染色切片進行定量分析。免疫組化染色切片經(jīng)Olympus BX53顯微鏡在10倍下觀察，并以其配備的DP72(Olympus)數(shù)碼照相機利用Olympus Cell Sens Ver1.2.1圖像攝取軟件攝取圖像，圖像像素為5 184×3 456。用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)定量測定每張切片相應部位的陽性細胞數(shù)及神經(jīng)纖維的累積光密度(IOD)及其測量面積(area,μm2)，求出其平均光密度值(IOD/area)，測量面積截取每張切片相同部位丘腦室旁核處753 185 μm2。

2 結 果

2.1 大鼠行為學觀察及處理經(jīng)腹腔注射KA(71±8) min后，大鼠表現(xiàn)為濕狗樣抖動、前肢陣攣，甚至全身陣攣、失去平衡跌倒伴口吐白沫。癇性發(fā)作持續(xù)30 min后，腹腔注射地西泮(10 mg·kg-1)終止發(fā)作。

2.2 免疫陽性細胞分布情況各區(qū)組腦組織的多部位免疫組化切片實驗表明：orexin-B免疫陽性細胞分布在大鼠下丘腦尤其是下丘腦外側(cè)區(qū)和穹窿周圍核，但是在海馬有可疑的陽性，且在8 h組orexin-B陽性最高，其次是3 d組。見圖1(插頁一)。

2.3 免疫陽性細胞數(shù)對照組和致癇后8 h、1 d、3 d和7 d組以及慢性復發(fā)型組orexin-B免疫陽性細胞的數(shù)目分別為73.89±46.31、66.26±40.82、67.61±42.58、92.31±46.24、32.75±30.25和77.82±57.28；7 d組與其他各組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其他相鄰組間免疫陽性細胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各區(qū)組orexin-B免疫陽性細胞呈現(xiàn)先稍減少后恢復，之后減少再恢復的趨勢。各區(qū)組orexin-B免疫組化染片結果見圖2(插頁一)。

2.4 神經(jīng)纖維的分布免疫組化染色切片檢測結果表明：orexin-B免疫反應陽性神經(jīng)纖維在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛，在皮層、海馬、丘腦、下丘腦、室旁核等等各個部位都有分布。

2.5 orexin-B神經(jīng)纖維定量對各區(qū)組大鼠的丘腦室旁核進行orexin-B免疫反應陽性神經(jīng)纖維的定量分析，對照組和致癇后8 h、1 d、3 d和7 d組以及慢性復發(fā)型組平均光密度值(IOD/area)結果分別為0.040 249 840±0.016 991 212、0.056 693 460±0.033 409 569、0.028 744 460±0.024 347 261、0.055 445 800±0.014 488 519、0.048 517 270±0.0144 987 200和0.039 411 090±0.010 738 182。隨著大鼠致癇后時間的變化，orexin-B免疫反應陽性神經(jīng)纖維平均光密度值變化呈現(xiàn)出先增加后減少，再增加后又減少的變化趨勢。1 d組與8 h和3 d組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其他相鄰組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組免疫組化染色結果見圖3(插頁一)。

3 討 論

癲癇是由于興奮性增加而抑制性減弱導致的高同步化放電，但其具體的發(fā)病機制目前尚未明確，只是認為其與中樞內(nèi)GABA抑制作用減弱或缺乏有關。Martin 等[9]證實：orexin能增強GABA電流，有實驗證明了orexin-B是如何興奮GABA能神經(jīng)元的，因此本實驗探討了orexin-B與癲癇的關系。orexin-B免疫陽性細胞的分布局限于下丘腦和穹窿周圍核，本實驗結果顯示：orexin-B免疫陽性細胞數(shù)呈現(xiàn)為先稍減少后恢復，之后減少再恢復的趨勢。揭示癲癇發(fā)作后第7天，orexin-B在神經(jīng)元細胞內(nèi)量最少，其他相鄰組間差異并不顯著，而Morales等[13]所做實驗中只檢測了誘發(fā)癲癇后第2天與第4天orexin-B細胞數(shù)與對照組相比無顯著差異，與本實驗中的檢測結果相符。orexin-B免疫陽性細胞在海馬有可疑的陽性，且在8 h組陽性最高，其次是3 d組，是否意味著在癲癇發(fā)作后海馬區(qū)有該神經(jīng)元細胞的增多有待進一步探究。orexin-B神經(jīng)纖維分布廣泛，在皮層、海馬、丘腦、下丘腦、室旁核等各個部位都有分布，其免疫陽性神經(jīng)纖維平均光密度值呈現(xiàn)出與其細胞數(shù)相反的變化。Morales等[13]的實驗表明：orexin-B神經(jīng)纖維在致癇后第2天比第4天減少，與本實驗結果相符合。

結合orexin-B免疫陽性細胞及其神經(jīng)纖維的檢測結果，本實驗有2個新發(fā)現(xiàn)：①orexin-B細胞數(shù)及其神經(jīng)纖維在大鼠癲癇發(fā)生后有變化；②兩者之間變化趨勢呈現(xiàn)出相反的關系，推測其原因為癲癇發(fā)作后，orexin-B物質(zhì)由神經(jīng)元內(nèi)經(jīng)其神經(jīng)纖維傳遞至其受體起作用，這表明其可能參與了癲癇神經(jīng)元放電和傳播的抑制調(diào)節(jié)作用，通過增加該物質(zhì)在大腦中的濃度可能有助于癲癇發(fā)作的控制。

[致謝：感謝協(xié)和醫(yī)科大學基礎研究所藥理教研室左萍萍教授及課題組楊楠老師等的幫助與指導。]

[參考文獻]

[1]Sakurai T,Amemiya A,Ishii M,et al.Orexins and orexin receptors: a family of hypothalamic neuropeptides and G protein-coupled receptors that regulate feeding behavior[J].Cell,1998,92(4):573-585.

[2]de Lecea L,Kilduff TS,Peyron C,et al.The hypocretins: hypothalamus-specific peptides with neuroexcitatory activity[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1998,95(1):322-327.

[3]Trivedi P,Yu H,MacNeil DJ,et al.Distribution of orexin receptor mRNA in the rat brain[J].FEBS Lett,1998,438(1/2):71-75.

[4]Greco MA,Shiromani PJ.Hypocretin receptor protein and mRNA expression in the dorsolateral pons of rats[J].Brain Res Mol Brain Res,2001,88(1/2):176-182.

[5]Marcus JN,Aschkenasi CJ,Lee CE,et al.Differential expression of orexin receptors 1 and 2 in the rat brain[J].J Comp Neurol,2001,435(1):6-25.

[6]Shahid IZ,Rahman AA,Pilowsky PM.Intrathecal orexin A increases sympathetic outflow and respiratory drive,enhances baroreflex sensitivity and blocks the somato-sympathetic reflex[J].Br J Pharmacol,2011,162(4):961-973.

[7]Chemelli RM,Willie JT,Sinton CM,et al.Narcolepsy in orexin knockout mice: molecular genetics of sleep regulation[J].Cell,1999,98(4):437-451.

[8]Baier PC,Hallschmid M,Se?k-Hirschner M,et al.Effects of intranasal hypocretin-1 (orexin A) on sleep in narcolepsy with cataplexy[J].Sleep Med,2011,12(10):941-946.

[9]Martin G,Fabre V,Siggins GR,et al.Interaction of the hypocretins with neurotransmitters in the nucleus accumbens[J].Regul Pept,2002,104(1/3):111-117.

[10]Rejdak K,Papuc E,Grieb P,et al.Decreased cerebrospinal fluid hypocretin-1 (orexin A) in patients after repetitive generalized tonic-clonic seizures[J].Epilepsia,2009,50(6):1641-1644.

[11]Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation: cortical areas[J].Electroencephalogr Clin Neurophysiol,1975,38(1):1-12.

[12]Paxinnos G,Watson C.諸葛啟釧.大鼠腦立體定位圖譜[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005:圖10-60.

[13]Morales A,Bonnet C,Bourgoin N,et al.Unexpected expression of orexin-B in basal conditions and increased levels in the adult rat hippocampus during pilocarpine-induced epileptogenesis[J].Brain Res,2006,1109(1):164-175.