陳國花 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 262200）

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口蹄疫診斷及疫苗等研究綜述

陳國花 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 262200）

1 FMDV的分類地位及形態(tài)特征

口蹄疫病毒(FMDV)屬于微核糖核酸病毒科中的口蹄疫病毒屬。FMDV是已知較小的動物RNA病毒，病毒粒子直徑23~25nm，呈圓形或六角形，由60個結(jié)構(gòu)單位構(gòu)成20面體。所含核酸為RNA，全長8.5kb。在負(fù)染標(biāo)本中，可見衣殼由32個殼粒組成，口蹄疫病毒的殼粒大于其它小RNA病毒的殼粒。取感染細(xì)胞培養(yǎng)物作超薄切片，進(jìn)行電子顯微鏡檢查，常可見到胞漿內(nèi)的口蹄疫病毒呈晶格狀排列。X線衍射分析證明，口蹄疫病毒除VP1蛋白第141~160位氨基酸突出于表面外，整個病毒粒子呈光滑平整的球形，不具有其它小RNA病毒表面的凹陷結(jié)構(gòu)。

2 FMDV的遺傳變異

FMDV的毒力和抗原性均易發(fā)生變異，經(jīng)過不斷的抗原“漂移”過程，導(dǎo)致一系列亞型的產(chǎn)生。FMDV基因組中編碼衣殼蛋白的核苷酸發(fā)生變異從而導(dǎo)致病毒抗原性的變異。分析口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白的差異，可以發(fā)現(xiàn)VP1的變異性最高，特別是其編碼病毒抗原的核苷酸序列是一個可變區(qū)，是由抗原表位的氨基酸缺失、添加或替換造成的。VP4幾乎不發(fā)生變異[1]。四種衣殼蛋白的變異順序VP1〉VP3〉VP2〉VP4。歐洲O、A、C三個型中任何兩個型的氨基酸同源性約為60%。曾有人對3個O1亞型的核苷酸序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)編碼VP1的核苷酸高度同源，達(dá)98%；在O1亞型VP1多肽的213個氨基酸中，三個毒株之間只有3個氨基酸殘基不同。但在幾個C3亞型毒株之間，核苷酸序列中有25個堿基序列不同，結(jié)果造成8~9個氨基酸殘基的變化。隨后又證實(shí)，各型病毒之間不僅組成抗原環(huán)的氨基酸種類不同，而且組成這種抗原環(huán)的氨基酸數(shù)目也有差異：以SAT3最多，為VP1 124~165號氨基酸；其次是O、A、C型，分別比SAT3少5、7、9個氨基酸。

3 口蹄疫診斷技術(shù)研究

FMD是偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，世界大部分地區(qū)時有發(fā)生，常在牛群及豬群大范圍流行。此病的致死率很低，但是感染率很高?？谔阋叩拇笠?guī)模流行，會給農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)造成極大的危害，并波及到市場上毛、皮、肉、奶的供應(yīng)以及以毛、皮、肉、奶為原料的食品加工業(yè)和輕工業(yè)，給畜牧業(yè)和進(jìn)出口貿(mào)易造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，直接威脅著國家聲譽(yù)和人類食品衛(wèi)生安全，因而受到國內(nèi)外的普遍關(guān)注。口蹄疫病毒共有7個血清型：O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3、Asia1型，每個型又可以進(jìn)一步分為亞型。由于不斷發(fā)生抗原漂移，因此并不能嚴(yán)格區(qū)分亞型?？谔阋咴\斷只能在指定的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。送檢樣品包括水泡液、剝落的水泡、抗凝血或血清等。死亡動物可采集淋巴結(jié)、扁桃體及心臟。樣品應(yīng)冰凍保存，或置pH7.6的甘油緩沖液中。目前口蹄疫的檢測技術(shù)主要有病毒分離技術(shù)、血清學(xué)檢測技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)等。

3.1 病毒分離技術(shù)

病毒分離技術(shù)是檢測口蹄疫的黃金標(biāo)準(zhǔn)，主要有細(xì)胞培養(yǎng)和動物接種2種方法。

3.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 檢測口蹄疫最初用的細(xì)胞是單層初代豬腎細(xì)胞，后來隨著細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的不斷增多，有許多培養(yǎng)細(xì)胞都可用于FMDV的分離。其中初代小牛甲狀腺(CYT)細(xì)胞分離FMDV時特別敏感[2]，此外還有小牛腎細(xì)胞[3]、倉鼠腎細(xì)胞系BHK21等。目前許多實(shí)驗(yàn)室都將CYT細(xì)胞和IBRS 2培養(yǎng)細(xì)胞(豬腎細(xì)胞系)作為分離FMDV的常規(guī)細(xì)胞，這2種細(xì)胞系可將FMDV和SVDV(豬水泡病病毒)區(qū)分開，因?yàn)镕MDV可在這2種細(xì)胞上生長，且有相似的細(xì)胞病變，而SVDV只能在IBRS 2細(xì)胞上生長。

3.1.2 動物接種 動物接種常用乳鼠進(jìn)行，通常情況下進(jìn)行病毒分離需要用8~10只小鼠，以便于觀察接種鼠的死亡情況和獲得足夠多的抗原，并在進(jìn)行補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)時獲得明顯的陽性結(jié)果。當(dāng)致病性毒株非常重要時，也可用牛等動物來分離病毒。

3.2 血清學(xué)檢測技術(shù)

血清學(xué)診斷技術(shù)主要有病毒中和試驗(yàn)(VNT)、CFT、間接血凝試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫熒光抗體試驗(yàn)、免疫熒光電子顯微鏡技術(shù)等。

3.2.1 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) CFT是較早的應(yīng)用于診斷FMD的血清學(xué)診斷技術(shù)之一，最初的CFT是在試管中進(jìn)行的，后來被微量法所替代，微量法操作簡便，節(jié)省試劑，但是CFT的敏感性不高，且易受樣品中的親補(bǔ)體性和抗補(bǔ)體物質(zhì)的干擾。

3.2.2 病毒中和試驗(yàn) 病毒中和試驗(yàn)是OIE推薦的檢測FMDV抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法。在進(jìn)行抗原鑒定時病毒中和試驗(yàn)比補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)要好，但體外VNT試驗(yàn)也有一些缺點(diǎn)，如需用的細(xì)胞生長不一致、病毒敏感性的變化、外源性微生物因子(如細(xì)菌和真菌)的可能性干擾以及被試血清對細(xì)胞的不同影響等等，這一方法必須使用活病毒，非普通實(shí)驗(yàn)室所能操作，而且中和試驗(yàn)全然不能區(qū)分免疫抗體和感染抗體。

3.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ELISA試驗(yàn)檢測口蹄疫具有特異、敏感、快速、簡便、可靠性好等特點(diǎn)，且能自動化操作，并能迅速的檢測大量樣品，在FMD的診斷中日益受到人們的重視，現(xiàn)已成為國際上檢測FMD的常規(guī)方法之一。

3.3 分子生物學(xué)技術(shù)

近年來，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，以及對FMDV研究的不斷深入，已經(jīng)建立起檢測FMDV的各種分子生物學(xué)方法，其中包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、核酸探針、核酸序列分析、電聚焦寡核苷酸指紋圖譜法、基因芯片技術(shù)等等。

3.3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) PCR診斷技術(shù)在使用時以特殊設(shè)計的引物作介導(dǎo)及在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用PAGE或瓊脂糖電泳或硝酸銀染色檢查，看擴(kuò)增出的DNA片段大小與設(shè)計是否相符。PCR檢測法與其它方法相比其特點(diǎn)是特異性好，靈敏度高，簡便快速，對檢測樣品要求低。在分子流行病學(xué)中RT-PCR可與序列分析結(jié)合研究不同分離株之間的系統(tǒng)關(guān)系，也有助于追蹤該病暴發(fā)的傳染源。

3.3.2 核酸探針 即用放射性同位素標(biāo)記核酸的cDNA拷貝，可以特異地同待檢樣品中的病毒核酸結(jié)合，這種結(jié)合可以通過放射自顯影顯現(xiàn)出來，這一方法是當(dāng)前最敏感的方法。其缺點(diǎn)是試驗(yàn)程序較為繁瑣，而且同位素標(biāo)記半衰期短，并污染環(huán)境。相關(guān)學(xué)者用32P標(biāo)記克隆在質(zhì)粒上的FMDV基因組聚合酶序列作為探針，對實(shí)驗(yàn)感染牛的食道/咽部刮取物進(jìn)行了檢測，認(rèn)為此法為進(jìn)出口動物FMD檢測提供了快速、準(zhǔn)確的檢測方法[4]。

4 口蹄疫疫苗的研制

使用滅活疫苗，需經(jīng)常重復(fù)免疫接種，才能維持保護(hù)，弱毒疫苗存在的散毒和毒力返祖現(xiàn)象、滅活疫苗中的活毒殘留問題及因毒株的抗原漂移和基因組的變異選擇而導(dǎo)致疫苗接種失敗等現(xiàn)象都可能造成FMD的大流行。同時疫苗的研制總是落后于病毒變異，造成現(xiàn)行的疫苗對當(dāng)時的流行毒株預(yù)防效果不理想，這也是FMD防治困難重重的另一重要原因。隨著對FMDV深入研究和知識的積累，已能從分子水平闡明病毒的基因結(jié)構(gòu)和免疫特點(diǎn)，重組DNA及相關(guān)技術(shù)的興起，推進(jìn)了口蹄疫疫苗的研究，開拓了口蹄疫基因工程苗研究的領(lǐng)域，使新一代口蹄疫疫苗的誕生成為可能。

4.1 傳統(tǒng)疫苗

4.1.1 活疫苗 FMDV容易發(fā)生變異，且不易致弱，有致病性，不安全，所以活疫苗不適宜用來防控FMD，目前世界上大多數(shù)國家已經(jīng)禁止使用此苗。

4.1.2 滅活疫苗 目前FMD主要是使用滅活疫苗進(jìn)行預(yù)防，且使用效果較其它類型疫苗效果好。由于活疫苗可能會因遺傳變異導(dǎo)致原疫苗的效力丟失或突變成強(qiáng)毒株而引發(fā)疾病，死疫苗滅活不徹底導(dǎo)致疾病流行等原因，研制安全、穩(wěn)定和抗原性強(qiáng)的新型疫苗便成為眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

4.2 新型疫苗的研制

4.2.1 基因工程亞單位疫苗 目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因和非結(jié)構(gòu)蛋白基因2A、3C串聯(lián)起來表達(dá)，可以產(chǎn)生76S的類病毒粒子，提純該病毒粒子用來免疫動物，其免疫效果類似于全病毒，可產(chǎn)生高水平的中和抗體，能抵抗強(qiáng)毒的攻擊，并徹底解決FMDV常規(guī)疫苗散毒的危險，顯示其良好的前景?，F(xiàn)只有A型FMDV基因工程疫苗試驗(yàn)證明具有相當(dāng)?shù)男Я?。目前我國已完成抗O型口蹄疫病毒基因工程疫苗的基因克隆和表達(dá)，用其制備的疫苗同時完成田間試驗(yàn)和區(qū)域性試驗(yàn)等一系列動物免疫試驗(yàn)，取得顯著效果。

4.2.2 基因缺失疫苗 世界上第一個基因工程缺失苗是由美國的Baylor醫(yī)學(xué)院和Texas大學(xué)聯(lián)合研制成功的一株豬偽狂犬病基因缺失疫苗。受這一研究以及隨后不同實(shí)驗(yàn)室成功結(jié)果的啟發(fā)，許多研究者也開始致力于口蹄疫基因缺失苗的研究。

4.2.3 活載體疫苗 2000年，Berinstein A等[5]發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)蛋白前體基因構(gòu)建的重組痘苗病毒免疫牛和小鼠后，用ELISA檢測動物血清發(fā)現(xiàn)，中和抗體滴度高，抗病毒保護(hù)效果好，動物應(yīng)答較強(qiáng)且持久，一次免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體在體內(nèi)可持續(xù)兩個月，加強(qiáng)接種后，動物可獲得更長的免疫力；另外，腺病毒和皰疹病毒也可以作為重組載體，Gregory A等[6]用表達(dá)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的腺病毒-5型免疫豬，4周后用相同劑量加強(qiáng)免疫一次，可產(chǎn)生高滴度的FMDV中和抗體，5/6免疫豬獲得了保護(hù)，用該重組病毒接種牛誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的抗FMDV抗體。以復(fù)制能力缺陷第5型腺病毒介導(dǎo)的免疫由于轉(zhuǎn)入本身缺乏復(fù)制機(jī)制，不會與宿主染色體基因整合，所以不會像弱毒疫苗出現(xiàn)毒力恢復(fù)的可能性。目前，腺病毒的基因結(jié)構(gòu)與功能研究得比較清楚，而且腺病毒活疫苗已在美國使用30年，證明是安全的，所以重組病毒具有發(fā)展活疫苗的前景。

4.2.4 核酸疫苗 90年代，隨著基因免疫概念的問世及完善，為FMDV免疫帶來契機(jī)。Shieh等[7](2001)根據(jù)包含有非甲基化胞嘧啶-磷酸-胸腺嘧啶(CpG)基序的寡核苷酸(ODN)能夠刺激細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且可充當(dāng)有效的佐劑，因此構(gòu)建了一個帶有FMDV O/Taiwan/97株衣殼蛋白VP1的質(zhì)粒DNA，并以CpG ODNs作為免疫刺激劑，結(jié)果證實(shí)用CpG ODNs 加強(qiáng)免疫后能夠使小鼠產(chǎn)生更高滴度的中和抗體。除此之外，研究者還將FMD基因疫苗與IL-2,GM-CSF等細(xì)胞因子或攜帶其編碼基因的質(zhì)粒DNA共同免疫動物，結(jié)果證實(shí)這種方法大大提高了基因疫苗的免疫效力。核酸疫苗是用攜帶免疫原基因的核酸制成。美國梅島動物病毒研究所正在研究口蹄疫病毒核酸疫苗，據(jù)稱有一定的效果，但核酸疫苗安全性方面尚有許多需要探討的問題，如染色體整合、免疫耐受、自身免疫和抗DNA抗體形成等諸多可能性。目前在動物試驗(yàn)中尚未出現(xiàn)這些現(xiàn)象，但是其安全性還需通過長期大量的觀察和試驗(yàn)加以證實(shí)。

[1] Daniel Haydon,Susan Lea, Liz Fry,et al.Characterizing Sequence Variation in the VP1 Capsid Proteins of Foot and Mouth Disease Virus(Serotype O) With to Virion Structure[J]. J MOI 1998,Evol,46:465-475.

[2] Hamblin,et al.A new enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. Ⅱ.Application.J Immunol Meth, 1986, 93:123-129.

[3] Hamblin,et al.A new enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. Ⅰ.Evaluation on of antibodies after infection and vaccination.Epidemiol Infection,1987,99:733-744.

[4] 農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)司. 家畜口蹄疫及其防制[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科技出版社, 1994: 137-138.

[5] Berinstein A, Tami C, Taboga,et al. (2000).Protective immunity against foot-and-mouth disease virus induced by a recombinant vaccinia virus[J]. Vaccine.18: 2231~2238.

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（2012–07–23）

S852.65+9

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1007-1733(2012)10-0089-03