林海蕤，毛熙光，王定玉

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

大量研究證實離子通道是調(diào)控細(xì)胞生長、分化和增殖等生理功能的結(jié)構(gòu)單元之一，其功能或結(jié)構(gòu)的異常多與如惡性腫瘤等重大疾病的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。1991～2008年以來，研究者發(fā)現(xiàn)鈣激活性中電導(dǎo)鉀離子通道(IKCal)在大量的惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)［1，4］，但尚缺乏其在宮頸癌中的表達(dá)研究。2009～2011年，我們從攜帶著遺傳信息的IKCalmRNA方面著手尋找宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌(簡稱宮頸癌)與正常宮頸上皮組織中IKCalmRNA表達(dá)的差異，嘗試從分子水平探討IKCal在宮頸癌發(fā)生中所起的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇在我院手術(shù)切除病理存檔的宮頸癌標(biāo)本15例，均經(jīng)病理檢查確診，平均年齡40.5歲，手術(shù)病理分期Ⅱa期;另選同期因子宮肌瘤等疾病進(jìn)行子宮全切除術(shù)標(biāo)本共18例(患者平均年齡51歲)為對照，病理檢查證實宮頸組織正常。

1.2 主要試劑和儀器 逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒購自大連寶生物公司;引物序列通過GenBank核酸數(shù)據(jù)庫檢索到的目的基因與參照基因引物序列，Oligo 5.0軟件設(shè)計引物，并經(jīng)NCBI BLASTn分析軟件驗證，符合引物要求后送上海生工生物公司合成;2×Taq PCR MasterMix(TIANGEN公司);100 bp DNA Ladder(TIANGEN公司)等。高速低溫離心機(jī)(美國科俊公司);DYY-8c型電泳儀(北京六一儀器廠);定量PCR儀iCycler(美國BIO-RAD公司);倒置顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)(日本Olympus);蛋白質(zhì)核酸測量儀ND-100(上?；蚬?;凝膠成像及分析系統(tǒng)LAS-300(日本FUJIFILM)。

1.3 IKCal mRNA檢測方法 ①提取總 RNA:按Trizol一步法分別提取正常宮頸上皮組織及宮頸癌組織的總RNA;并用分光光度計測定總RNA的濃度，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳證實均有清晰的18 S和28 S條帶。②合成cDNA:按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作合成cDNA，使用IKCal引物序列如下:上游為5'-GTGCGTGCAGGATTTAGGG-3'，下 游 為 5'-TGCTAAGCAGCTCAGTCAGGG-3';內(nèi)參GAPDH引物序列如下:上游為5'-GGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3'，下游為5'-ATGCTGGCGCTGAGTACGTC-3'。③PCR反應(yīng):擴(kuò)增體系為引物(上游引物和下游引物各1.0 μL)2.0 μL，反應(yīng)液 12.5 μL，cDNA 1 μg，反應(yīng)體系總體積25 μL。反應(yīng)條件為94℃ 4 min，94℃ 45 s、56℃ 45 s、72℃ 1 min共30循環(huán)，72℃延伸5 min。④取20 μL PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳(0.5μg/mL溴化乙錠染色)，鑒定擴(kuò)增的 PCR產(chǎn)物，并通過凝膠成像及分析系統(tǒng)對電泳圖片進(jìn)行拍照，分析各特異擴(kuò)增條帶的原始吸光度(A)值，以IKCal與GAPDHA值的比值為組織中IKCal mRNA的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 電泳圖像采用Multi Gauge分析軟件定量分析后，數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件行隨機(jī)獨(dú)立均數(shù)比較的Independent-Samples t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

產(chǎn)物基因片段位于200～900 bp，其中參照基因片段約為300 bp，目的基因片段約為800～900 bp，電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增出的目的基因片段分子量大小與預(yù)期目的基因片段符合。宮頸癌組織中IKCal mRNA陽性表達(dá)11例(73.33%)，陽性表達(dá)量為1.14±0.45;宮頸正常組織中陽性表達(dá) 2例(11.11%)，陽性表達(dá)量為 0.86 ±0.23(P 均 ＜0.05)。

3 討論

mRNA承載著從DNA轉(zhuǎn)錄來的遺傳信息，并承擔(dān)著將其轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中核糖體指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的功能。通過對組織中IKCal mRNA的檢測，可以了解IKCal在該組織中合成的水平及其含量。在對細(xì)胞有絲分裂過程的研究中發(fā)現(xiàn)［5，6］，大量存在的IKCal通道蛋白可造成宮頸上皮細(xì)胞內(nèi)外Ca2+濃度的失衡，并作為轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路中的效應(yīng)元件參與細(xì)胞有絲分裂的調(diào)控，使細(xì)胞脫離靜止期，促使細(xì)胞由G1期向S期發(fā)展，造成正常的有絲分裂過程失控。使用藥物阻斷IKCal，則會使細(xì)胞停留在G0期而停止細(xì)胞增殖過程［7］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，IKCal在子宮內(nèi)膜癌［4］、乳腺癌［3］、前列腺癌［2］及胰腺癌［9］等惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)，在離體培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中使用IKCal阻斷劑可以在很大程度上抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。用IKCal通道阻斷劑克霉唑處理宮頸癌Hela細(xì)胞后，可以觀察到克霉唑以濃度和時間依賴的方式抑制HeLa細(xì)胞的增殖，下調(diào) IKCal mRNA的表達(dá)水平，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［10］。也有研究［11］發(fā)現(xiàn) IKCal在淋巴細(xì)胞、鼠成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞以及多種癌細(xì)胞株的有絲分裂過程IKCal通道表達(dá)上調(diào)，是細(xì)胞增殖過程中的重要調(diào)節(jié)因子。同時，IKCal在內(nèi)皮細(xì)胞存在表達(dá)，且參與內(nèi)皮的增殖過程［12］。過度表達(dá)的IKCal可以通過影響細(xì)胞增殖特性而導(dǎo)致細(xì)胞增殖和凋亡比例失調(diào)，同時它還可以通過改變惡性腫瘤細(xì)胞的遷徙能力、腫瘤血管通透性、血管增殖能力等因素，導(dǎo)致惡性腫瘤具有轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的特性［13］。

本研究通過對15例宮頸癌組織IKCal mRNA相對定量檢測后發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)IKCal目的基因條帶者11例，陽性表達(dá)率為73.33%，表達(dá)水平為1.14±0.45;均高于正常宮頸組織中的2例、11.11%和0.86 ±0.23;P 均 ＜0.05。由此可見，宮頸癌組織與正常宮頸組織中IKCal mRNA表達(dá)存在統(tǒng)計學(xué)差異，該結(jié)果與目前文獻(xiàn)［14］報道的IKCal在惡性腫瘤組織中的表達(dá)情況相一致。與正常宮頸組織比較，宮頸癌組織中IKCal mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，這可能與宮頸癌組織中IKCal蛋白的合成較正常宮頸組織旺盛有關(guān)。過度表達(dá)的IKCalm RNA可指導(dǎo)合成相關(guān)的功能性蛋白質(zhì)，從而為細(xì)胞增殖創(chuàng)造了較高的IKCal蛋白表達(dá)環(huán)境，促使大量的宮頸鱗狀上皮細(xì)胞進(jìn)入增殖期，使有絲分裂過程失控造成異常的細(xì)胞增殖［7］。由于IKCal具有調(diào)節(jié)細(xì)胞膜電位及細(xì)胞內(nèi)外Ca2+濃度的功能，細(xì)胞中大量增多的IKCal可能使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，干擾由Ca2+調(diào)控的宮頸正常細(xì)胞存活、增殖、分化等生理活動，尤其是對細(xì)胞周期中大量合成RNA和蛋白質(zhì)的G1期影響更為明顯。曾有研究者［15］通過阻斷 IKCal通道將細(xì)胞阻滯于G1早期，使其停止或減慢細(xì)胞的增殖而達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的目的。過度表達(dá)的IKCal造成宮頸上皮細(xì)胞有絲分裂過程的失控，可能是宮頸癌的發(fā)生機(jī)制之一。

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