衛(wèi)永華，于雁飛，王春玲，羅依青，侯麗華*

（1.天津科技大學(xué)教育部食品營養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.山東永康食品有限公司，山東 煙臺(tái) 264006）

釀造醬油是以大豆和小麥為原料，利用微生物分泌的各種酶將植物蛋白質(zhì)及碳水化合物水解、發(fā)酵形成的具有獨(dú)特色、香、味、體的液體調(diào)味品[1]。S酵母又稱魯氏酵母，是最常見的耐高滲酵母，在醬油釀造過程中，S酵母能夠形成乙醇、高級(jí)醇、酯類、糠醛、琥珀酸和4-羥基-呋喃酮類等物質(zhì)[2-3]，對(duì)醬油風(fēng)味的形成起到重要的作用。但是在高鹽稀態(tài)醬油的實(shí)際生產(chǎn)中，醬醪的含鹽量通常高于18%，這極大的影響了S酵母的生存狀態(tài)和發(fā)酵活力，使其不能發(fā)揮應(yīng)有的作用。因此S酵母的耐鹽能力是利用其改善醬油風(fēng)味的一個(gè)“瓶頸”。

S3-2酵母是本實(shí)驗(yàn)室以S酵母為出發(fā)菌株，利用基因組重組技術(shù)構(gòu)建的一株具有高耐鹽度的新型酵母菌株[4]。以S酵母為對(duì)照菌株，對(duì)S3-2耐鹽能力和香氣成分產(chǎn)生能力進(jìn)行比較研究，將可以為S3-2酵母在高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵中的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)，對(duì)促進(jìn)S3-2酵母在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用也具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 菌種

S酵母由天津科技大學(xué)菌種保藏中心提供；S3-2酵母是本試驗(yàn)室以S酵母為出發(fā)菌株，經(jīng)過基因組重組技術(shù)構(gòu)建的新型耐鹽酵母。

1.2 試驗(yàn)試劑

本實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

QP2010SE氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基[5]：酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g溶于1000mL蒸餾水中，121℃滅菌15min。固體培養(yǎng)基需另添加15g～20g瓊脂粉。

YPDN培養(yǎng)基：在YPD培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，按試驗(yàn)需要加入不同質(zhì)量的NaCl，121℃滅菌15min。

YPD發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取酵母粉10g、蛋白胨20g、NaCl 180g和葡萄糖60g溶于1000mL水中，115℃、15min滅菌。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 S3-2酵母和S酵母的活化

從S3-2和S酵母的斜面培養(yǎng)基上各挑取一環(huán)酵母，接入YPD液體培養(yǎng)基中，于30℃、150r/min過夜活化培養(yǎng)。

1.5.2 S3-2酵母和S酵母耐鹽能力的比較

取適量活化好的酵母菌液轉(zhuǎn)接至含鹽量分別為18%、19%、20%和21%的50 mL YPDN液體培養(yǎng)基中，使菌液初始濃度達(dá)到5×106個(gè)/mL，并置于30℃、150r/min條件下振蕩培養(yǎng)。自接種（零時(shí)）算起，每隔12h在無菌室取樣，測(cè)定OD600，并繪制S3-2酵母和S酵母生長(zhǎng)曲線。

1.5.3 S3-2酵母和S酵母基礎(chǔ)發(fā)酵性能比較研究

將活化好的S3-2酵母和S酵母依次轉(zhuǎn)接于含鹽量為12%和16%的YPDN液體培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期。將擴(kuò)大培養(yǎng)的酵母轉(zhuǎn)接于裝有500mL YPD發(fā)酵培養(yǎng)基的厭氧瓶中，并置于30℃靜置發(fā)酵。每2d測(cè)定一次還原糖含量、乙醇含量和風(fēng)味物質(zhì)。全體樣品分為S酵母組和S3-2酵母組，每組樣品設(shè)3個(gè)平行樣品。

1.5.4 還原糖含量的測(cè)定[6-7]

采用菲林試劑容量法進(jìn)行還原糖含量的測(cè)定。

1.5.5 乙醇含量[7-8]

采用蒸餾法法測(cè)定。

1.5.6 香氣成分的測(cè)定

樣品前處理[9]：本試驗(yàn)利用頂空固相微萃取法（SPME）對(duì)發(fā)酵液中的香氣成分進(jìn)行提取[10]。首先將聚二甲基硅氧烷（PDMS）固相微萃取頭在氣相色譜的進(jìn)樣口老化至無雜峰，老化溫度250℃，時(shí)間50min。取5g發(fā)酵液樣品于15mL干凈的萃取瓶中，在45℃水浴平衡30min，再將老化結(jié)束的PDMS萃取頭插入瓶中。萃取頭與樣品液面應(yīng)保持一定距離，避免萃取頭表面沾水。萃取溫度45℃，萃取時(shí)間30min。

色譜條件[11]：VF-5MS毛細(xì)管色譜柱（30mm×0.25mm×0.25mm），載氣：氦氣（純度99.999%），流量1mL/min，分流比5:1。PDMS萃取頭插入進(jìn)樣孔，250℃解吸5min。

程序升溫：起始溫度40℃，保持30min，以4℃/min的速度升至150℃，保持1min，再以8℃/min的速度升至250℃，保持6min。

質(zhì)譜條件：接口溫度280℃，離子源溫度220℃，溶劑延遲時(shí)間1.5min，電子能量70eV，掃描質(zhì)量范圍43u～500u。

數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)收集用HP化學(xué)工作站軟件對(duì)照NIST05庫進(jìn)行，成分先由譜庫初步鑒定，結(jié)合化學(xué)成分的保留時(shí)間、質(zhì)譜、實(shí)際成分、保留指數(shù)并參考相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]進(jìn)行定性。定量采用面積歸一化法相對(duì)定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 S3-2酵母和S酵母耐鹽能力的確定

取活化好S3-2酵母和S酵母菌液轉(zhuǎn)接至含鹽量分別為18%、19%、20%和21%的YPDN液體培養(yǎng)基中，30℃、150r/min條件下振蕩培養(yǎng)，其生長(zhǎng)狀況見圖1和圖2。

圖1 酵母S在高鹽YPDN培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig.1 The growth of yeast S grown in YPDN medium with high concentration salt

由圖1和圖2可以看出，相同接種量的S3-2酵母和S酵母在不同鹽度條件下表現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)狀態(tài)。S3-2酵母在含鹽量達(dá)21%的培養(yǎng)基中仍能夠良好生長(zhǎng)，但S酵母能生長(zhǎng)的最大鹽度只有19%。且在19%的YPDN培養(yǎng)基中，S酵母進(jìn)入對(duì)數(shù)期的時(shí)間比S3-2酵母推遲了將近24h；在18%鹽度培養(yǎng)基中，S酵母平穩(wěn)期菌體濃度也低于S3-2在平穩(wěn)期的菌體濃度。表明S3-2酵母比S酵母具有更高的耐鹽能力，其在高鹽環(huán)境中能更好地進(jìn)行生存和代謝活動(dòng)。

圖2 S3-2酵母在高鹽YPD培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig.2 The growth of yeast S3-2 grown in YPD medium with high concentration salt

2.2 S3-2酵母和S酵母基礎(chǔ)發(fā)酵性能研究

酵母在醬醪的后期發(fā)酵中是一個(gè)以還原糖為碳源，進(jìn)行厭氧代謝，產(chǎn)生醇類等風(fēng)味物質(zhì)的過程。YPD培養(yǎng)基含有豐富的碳源和氮源，與醬醪相比，其組分簡(jiǎn)單，干擾少，有利于在短期內(nèi)對(duì)S3-2酵母和S酵母的基礎(chǔ)發(fā)酵特性進(jìn)行研究。同時(shí)，為了使YPD發(fā)酵培養(yǎng)基中的還原糖含量與醬醪接近，本研究將培養(yǎng)基中葡萄糖含量提高至6%。

2.2.1 S3-2酵母和S酵母的還原糖消耗能力和產(chǎn)乙醇能力比較

為了分別對(duì)S3-2酵母和S酵母的還原糖消耗能力和乙醇產(chǎn)生能力進(jìn)行比較研究，本研究定時(shí)對(duì)接入2株酵母的YPD發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行還原糖和乙醇含量測(cè)定，結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖和乙醇含量變化Fig.3 The changes of glucose and ethanol in the fermentation medium

圖3表明，在前2d內(nèi)，由于S酵母菌體對(duì)高鹽環(huán)境需要一個(gè)適應(yīng)過程，所以生長(zhǎng)代謝不旺盛，還原糖的消耗和乙醇含量的增加都較為平緩。而S3-2酵母適應(yīng)高鹽環(huán)境能力較強(qiáng)，在發(fā)酵第2d，乙醇的生成和還原糖的消耗反應(yīng)已經(jīng)以較快的速率進(jìn)行。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，S和S3-2代謝速度加快，還原糖的消耗和乙醇的形成都有較快速的增加，但是S3-2酵母的還原糖消耗和乙醇產(chǎn)生速率要明顯高于S酵母。在發(fā)酵進(jìn)行10d之后，由于還原糖被消耗殆盡和菌體的死亡，S3-2和S酵母產(chǎn)乙醇速率趨于平緩。綜上所述，在高鹽培養(yǎng)基中，S3-2酵母的還原糖消耗能力和乙醇產(chǎn)生能力要高于S酵母。乙醇具有清爽的香氣，是醬油的基礎(chǔ)物質(zhì)。同時(shí)乙醇還可通過氧化和酯化反應(yīng)生成有機(jī)酸和酯類物質(zhì)，S3-2酵母較高的乙醇產(chǎn)生能力對(duì)促進(jìn)醬油香氣形成是十分必要的。

2.2.2 S3-2酵母和S酵母產(chǎn)生香氣成分能力的比較

為了研究S3-2酵母和S酵母在高鹽環(huán)境中產(chǎn)生的香氣成分的特點(diǎn)，本研究對(duì)其在含鹽量為18%的YPD發(fā)酵培養(yǎng)基中的香氣成分進(jìn)行GC-MS測(cè)定，結(jié)果見表1～表4。

從表1～表4可以知道，利用SPME-GC-MS方法檢測(cè)出來的風(fēng)味物質(zhì)包括酸類、醇類、酯類、酚類、醛類、醚類和酮類等化合物。本研究在S3-2酵母和S酵母發(fā)酵過程中檢出的風(fēng)味物質(zhì)分別有43種和41種，表明S3-2酵母在高鹽環(huán)境中可利用YPDN發(fā)酵培養(yǎng)基比S酵母產(chǎn)生較多的風(fēng)味物質(zhì)。酵母在不同的發(fā)酵時(shí)期產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)種類和含量有著顯著地差異。

醇類是發(fā)酵體系中最重要的風(fēng)味物質(zhì)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，其種類和含量一直處于上升狀態(tài)。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，與S酵母相比，S3-2酵母產(chǎn)生的醇類物質(zhì)種類增加2種，含量提高4.89%。用PDMS固相微萃取纖維頭吸附的醇類多為高級(jí)醇，其中苯乙醇是醬油中關(guān)鍵的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[14]，其除在添加S酵母的0d發(fā)酵培養(yǎng)基中未被檢出外，在其他樣品中一直以較高含量存在。苯乙醇具有清甜的玫瑰樣花香，對(duì)醬油風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[15-16]。苯乙醇既能被氧化為苯乙醛和苯乙酸，又可與醇形成縮醛，還可與酸類物質(zhì)形成苯乙酯類化合物，所以在后期相對(duì)含量減少。新戊醇有薄荷油味，在發(fā)酵的全部過程中都一直能檢測(cè)到；1-壬醇具有類似桔子和甜橙的氣息；十一醇具有玫瑰花香和柑橘、菠蘿的果香。這3種醇雖然相對(duì)含量不大，但在發(fā)酵過程中一直存在，可能也是S3-2酵母和S發(fā)酵產(chǎn)生的特征性風(fēng)味。1，9-壬二醇僅在S酵母發(fā)酵到第6d時(shí)檢出，且不存在于S3-2酵母發(fā)酵體系中。3-呋喃甲醇具有刺激性，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行含量降低。

酯類物質(zhì)的種類和相對(duì)含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。但表3、表4的結(jié)果表明，S3-2酵母產(chǎn)生的酯類物質(zhì)種類和含量略低于S酵母。乙酸乙酯具有水果香氣，其是由酒精發(fā)酵階段的主產(chǎn)物——乙醇與乙酸酯化而成，隨發(fā)酵的進(jìn)行含量升高。乙酸異戊酯具有較強(qiáng)的新鮮果香，稍甜，是蘋果、香蕉的主要香氣成分之一，主要由乙酸和異戊醇酯化生成。癸酸乙酯有葡萄酒香氣；丁酸苯乙酯呈蜂蜜的甜香味；十四酸乙酯呈椰子的香味；十六酸乙酯呈微弱奶油香氣。以上這幾種酯類化合物都可通過有機(jī)酸與乙醇的酯化反應(yīng)生成。其在2株酵母的發(fā)酵體系中一直存在，但相對(duì)含量都不高，可能與發(fā)酵周期短，酯化反應(yīng)進(jìn)行不完全有關(guān)。

表1 S 酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的香氣成分的變化Table 1 The changes of aroma components of YPDN fermentation medium adding S yeast

表2 S3-2 酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的香氣成分的變化Table 2 The changes of aroma component of YPDN fermentation medium adding S3-2 yeast

表3 S 酵母在YPD 培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生的香氣成分的含量和種類變化Table 3 Changes of relative contents of different classes of aroma components in YPDN fermentation medium adding yeast S

表4 S3-2 酵母在YPD 培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生的香氣成分的含量和種類變化Table 4 Changes of relative contents of different classes of aroma components in YPD fermentation medium adding yeast S3-2

辛酸乙酯有類似白蘭地的香氣，并有甜味；棕櫚酸乙酯呈微弱蠟香和奶油香氣；癸酸乙酯帶花生香氣的油狀液體。這3種乙酯類化合物也是一些酒類飲料的主要風(fēng)味成分，僅在S3-2酵母發(fā)酵體系被檢出。

本部分檢出的有機(jī)酸主要有丁酸、異戊酸、2-甲基丁酸和苯乙酸。其中，丁酸用作香味劑時(shí)，使用極微量時(shí)就能發(fā)出很強(qiáng)、很濃的氣味。其還參與酯化反應(yīng)生成有愉快水果香味的丁酸乙酯和有雪梨香味丁酸異戊酯；苯乙酸廣泛存在于葡萄、草莓、可可、綠茶、蜂蜜等中。苯乙酸可能主要是由苯乙醇氧化而來。在低濃度時(shí)具有甜蜂蜜味，并且具有很強(qiáng)的殺菌作用。這4種物質(zhì)在2個(gè)發(fā)酵體系中的含量相差不大。

本研究中被檢測(cè)的羰基類化合物種類和含量都比較少，主要的有乙二醇甲醚、異戊醚和2，4-二叔丁基苯酚，其在2個(gè)發(fā)酵體系中均被檢出。其中需要注意的是乙二醇甲醚和異戊醚具有一定的毒性，在發(fā)酵過程中應(yīng)盡量避免其的生成。2，4-二叔丁基苯酚屬醫(yī)藥中間體和材料中間體，但在本試驗(yàn)中大多呈跳躍性走低的趨勢(shì)。吡嗪類化合物主要有2-乙基-3-甲基吡嗪（具有加熱牛肉時(shí)發(fā)出的香味）和2，6-二甲基-吡嗪（呈刺鼻的炒花生香氣），其主要在發(fā)酵前期產(chǎn)生，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，含量越來越低。這充分說明在復(fù)雜的生物發(fā)酵過程中，許多物質(zhì)會(huì)處于不斷的分解與合成中。

3 結(jié)論

綜上所述，S3-2酵母比S酵母具有更高的耐鹽能力。在含鹽量為18%的YPD發(fā)酵培養(yǎng)基中，具有更高的高級(jí)醇類物質(zhì)產(chǎn)生能力。結(jié)合S3-2酵母較高的乙醇產(chǎn)生能力，可以初步判斷其為醇香型酵母。豐富的醇類物質(zhì)不但能增加醬油的醇香，還可以為醬油后期的酯化反應(yīng)提供充足的原料，因此，S3-2酵母的應(yīng)用將對(duì)醬油風(fēng)味的提高有著重要的意義。

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