關(guān)淑霞,葉海春,范瑩瑩

(東北石油大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，黑龍江 大慶 163318)

在油田生產(chǎn)過程中，硫酸鹽還原菌(Sulphate reducing bacteria，SRB)的大量繁殖造成一系列嚴(yán)重問題：油田注水設(shè)備的腐蝕、地下油層被污染、管線堵塞等。據(jù)報(bào)道，美國由于SRB造成生產(chǎn)井的腐蝕約占77%以上，每年經(jīng)濟(jì)損失約120億～130億美元[1，2]。為控制SRB的大量繁殖，常采用投加殺菌劑的方法，但隨著細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng)，殺菌劑投加量及殺菌費(fèi)用不斷增加。若能及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測SRB，則能有效控制殺菌劑投加量。

目前，檢測SRB的技術(shù)主要有以下幾種：傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測技術(shù)、顯微鏡直接檢測技術(shù)、傳感器檢測技術(shù)、代謝物檢測技術(shù)、PCR技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)等。作者在此綜述了近年來國內(nèi)外SRB檢測技術(shù)的研究新進(jìn)展，并分析比較各種檢測技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，擬為選擇更為有效的檢測方法提供依據(jù)，也為進(jìn)一步完善檢測技術(shù)指明方向。

1 SRB的生長特性

SRB是指能將亞硫酸鹽、硫酸鹽、硫代硫酸鹽等含硫氧化物及單質(zhì)硫還原成H2S的細(xì)菌的統(tǒng)稱；是一類營養(yǎng)類型多樣、形態(tài)各異、能利用含硫物質(zhì)或利用其它氧化態(tài)硫化物作為電子受體進(jìn)行異化有機(jī)物質(zhì)的厭氧細(xì)菌。SRB的生長繁殖受到很多因素的影響，如溫度、pH值、礦化度及聚丙烯酰胺(HPAM)濃度等。山丹等[3]研究了溫度、pH值、礦化度及HPAM濃度對SRB優(yōu)勢菌生長的影響，結(jié)果表明：油田污水中SRB生長的最佳溫度為40 ℃、最佳pH值為8，污水中礦化度在9000 mg·L-1時(shí)較合適，HPAM濃度在500 mg·L-1為宜；對SRB生長影響最大的是pH值，HPAM濃度和溫度次之，影響最小的是礦化度；當(dāng)溫度高于50 ℃或低于20 ℃、pH值大于9或小于7、 HPAM濃度超過1000 mg·L-1時(shí)均可能對SRB有抑制作用。Larry等研究發(fā)現(xiàn)，SRB生長環(huán)境的Eb必須低于-150 mV。張小里等[4]研究發(fā)現(xiàn)：SRB能夠耐受氧氣濃度為4.5 mg·L-1的環(huán)境，但是溶解氧的濃度不能超過9.0 mg·L-1；能夠正常生長在NaCl濃度小于0.818%的溶液中，當(dāng)NaCl濃度在0.972%～2.228%時(shí)，SRB只能存活在水下沉積物中，當(dāng)NaCl濃度大于2.45%時(shí)，SRB不能存活；Fe2+含量小于13 mg·L-1時(shí)SRB的生長繁殖受到抑制，隨著溶液中Fe2+含量的增加，SRB代謝旺盛，生長高峰期延長，高含量的Fe2+對SRB生長繁殖沒有抑制作用；但在有氧和無氧環(huán)境下SRB生長的適宜pH值不同。

2 SRB的檢測技術(shù)

2.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測技術(shù)

傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測技術(shù)是目前油田應(yīng)用較為廣泛的方法。其原理是：將待測污水樣用1 mL無菌注射器逐級注射到細(xì)菌測試瓶中接種稀釋，恒溫培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)菌的陽性反應(yīng)和稀釋倍數(shù)，計(jì)算污水樣中細(xì)菌的含量。該法的依據(jù)是APIRP-38美國石油學(xué)會(huì)推薦的地下注入水分析方法中的絕跡稀釋法。白莉[5]發(fā)明了能直接用于測定SRB含量的測試液和測試瓶。

傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測技術(shù)主要是用培養(yǎng)基激活SRB，使代謝產(chǎn)物與Fe2+反應(yīng)生成沉淀，通過觀察測試瓶內(nèi)的陽性反應(yīng)來確定SRB含量。該方法很大程度上取決于SRB的活性，當(dāng)樣品中SRB含量少但活性高時(shí)，發(fā)生的細(xì)菌陽性反應(yīng)比較明顯，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果偏高；當(dāng)樣品中SRB含量多但活性低時(shí)，發(fā)生的細(xì)菌陽性反應(yīng)不明顯，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低。

傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是：操作簡單，成本低；不易染菌，抗干擾性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確性較高。缺點(diǎn)是：培養(yǎng)時(shí)間長(14 d)；檢測結(jié)果的重現(xiàn)性差；培養(yǎng)菌種不完全導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低?？s短培養(yǎng)時(shí)間和完善培養(yǎng)基是該方法有待提高的方面。

2.2 顯微鏡直接檢測技術(shù)

Galbraith等[6]用異硫氰酸鹽熒光素(FITC)和間接熒光抗體技術(shù)(IFA)定量測定細(xì)菌總數(shù)和SRB的總含量。由于FITC可粘附在細(xì)菌的蛋白質(zhì)上，因此，將經(jīng)FITC處理過的微生物置于帶有熒光的顯微鏡下放大觀察，即可得到細(xì)菌的總數(shù)，但不能計(jì)算出SRB的總含量，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果偏高；因IFA僅只粘附在SRB上，所以在熒光顯微鏡下能很明顯地觀察并計(jì)算出SRB的總含量。陳蓉等[7]在傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合顯微鏡直接檢測技術(shù)，開發(fā)出了一種快速檢測SRB的方法，即將待測水樣用1 mL無菌注射器逐級注射到測試瓶中稀釋，然后在恒溫箱中培養(yǎng)2 d，再用石炭酸—品紅染色液進(jìn)行染色處理，被染色處理后的SRB在生物顯微鏡下呈現(xiàn)紫紅色略帶彎曲狀，結(jié)合絕跡稀釋法的計(jì)數(shù)原理即可計(jì)算出SRB的總含量。

顯微鏡直接檢測技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是：培養(yǎng)時(shí)間短(約2 d)；操作簡單，成本低。缺點(diǎn)是：需要特定染色劑和專業(yè)人員操作；對死活細(xì)菌不能辨別，檢測結(jié)果偏高且重現(xiàn)性差。

2.3 現(xiàn)代檢測技術(shù)

現(xiàn)代檢測技術(shù)是不依靠培養(yǎng)基激活SRB的生長、繁殖，而是借助現(xiàn)代技術(shù)手段直接檢測SRB含量的方法。與傳統(tǒng)的檢測技術(shù)相比，現(xiàn)代檢測技術(shù)檢測速度快、檢測結(jié)果較為準(zhǔn)確且重現(xiàn)性好。

2.3.1 傳感器檢測技術(shù)

傳感器檢測技術(shù)的原理[8]：SRB在無氧條件下將硫酸鹽中的硫還原成S2-，同時(shí)將樣品中的有機(jī)物氧化，其代謝方程可表示為：

式中：“C”表示有機(jī)物；M表示價(jià)數(shù)為2的金屬離子。從方程式可知，可直接用S2-選擇性電極和AgCl參比電極測量溶液中的電動(dòng)勢，然后根據(jù)電動(dòng)勢計(jì)算出S2-的濃度，ASTM的檢測方法認(rèn)為溶液中H2S的濃度大于50×10-6就能檢測到SRB的存在。利用該原理，黃彥良等[9]發(fā)明了一種SRB測量傳感器，能夠?qū)RB含量進(jìn)行現(xiàn)場檢測。

傳感器檢測技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是：檢測速度快，溶液中菌濃度大于50×10-6時(shí)，只需2 ～3 d就能檢測出細(xì)菌含量；無H2S氣體產(chǎn)生；便于在線分析；能夠清晰地描繪出細(xì)菌生長的4個(gè)階段。缺點(diǎn)是：溶液中菌濃度低于50×10-6時(shí)，檢測不到細(xì)菌含量；不利于現(xiàn)場測試。

2.3.2 代謝物檢測技術(shù)

SRB的代謝活性直接反映了SRB在油田生產(chǎn)中的危害程度，由此研究者們提出通過測定SRB代謝產(chǎn)物H2S的含量來對SRB進(jìn)行檢測。李婉義等[10]建立了TIMB法，此法的原理為：培養(yǎng)液中三碘化亞甲基藍(lán)與維生素C反應(yīng)生成氧化型亞甲基藍(lán)，使得溶液呈藍(lán)色；在遇到SRB代謝產(chǎn)物S2-時(shí)，生成還原型亞甲基藍(lán)，使得溶液變?yōu)闊o色；從而計(jì)算出SRB的含量。TIMB法的優(yōu)點(diǎn)是：操作簡單、耗時(shí)短、不產(chǎn)生H2S氣體。缺點(diǎn)是：三碘化亞甲基藍(lán)與維生素C發(fā)生反應(yīng)，影響檢測結(jié)果，需嚴(yán)格控制維生素C的用量；對被檢測SRB在溶液中的含量有要求；辨別顏色時(shí)存在人為誤差，檢測結(jié)果的精確度不是很高。

SRB的胞內(nèi)含有特定的腺苷-5′-磷酸硫酸鹽還原酶(APS)，可催化還原腺苷-5′-磷酸硫酸鹽生成還原產(chǎn)物，還原產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)，將反應(yīng)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)菌量讀數(shù)卡進(jìn)行比較，間接計(jì)算出樣品中的SRB含量(還原產(chǎn)物的含量直接決定顯色反應(yīng)的強(qiáng)弱)。Odom等[11]利用這一原理檢測出污水中SRB的含量。美國Conoco公司通過檢測SRB中特有APS來直接測定污水樣中SRB的含量。樣品經(jīng)超聲波破碎處理后，SRB釋放出胞內(nèi)特有APS，APS與檢測系統(tǒng)的抗體接觸，就能快速檢測出水樣中SRB的含量[12]。該方法優(yōu)點(diǎn)是：檢測時(shí)間短(僅20 min)；不受溶液中礦化度和有機(jī)物殘?jiān)母蓴_；由于抗體的專一性，檢測結(jié)果準(zhǔn)確度高；操作簡單，適合現(xiàn)場作業(yè)。缺點(diǎn)是：專一性強(qiáng)，僅僅對SRB有檢測效果；檢測設(shè)備價(jià)格昂貴。

2.3.3 PCR技術(shù)

隨著PCR技術(shù)的成熟、操作復(fù)雜程度和成本的降低，其應(yīng)用日趨廣泛。馬放等[13]申請了SRB直接倍比稀釋PCR快速測定方法的專利，以倍比稀釋的SRB的菌體為模板直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。Ben-dov等[14]以SybrGreen為熒光標(biāo)記,利用腺苷-5′-磷酸硫酸鹽還原酶基因(apsA)和PCR擴(kuò)增異化型硫酸鹽還原酶基因(dsrA)對SRB含量進(jìn)行測定，其原理為：通過引入熒光標(biāo)記分子SybrGreen，使得反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光信號與PCR產(chǎn)物含量成正比關(guān)系，從而實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是：檢測時(shí)間大大縮短；檢測結(jié)果準(zhǔn)確度高，可重復(fù)性好。缺點(diǎn)是：技術(shù)難度高，需要專業(yè)的操作人員；現(xiàn)場檢測困難；還需進(jìn)一步研究水中的雜質(zhì)干擾因素。

2.3.4 熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)

FISH技術(shù)不需要對微生物進(jìn)行培養(yǎng)，它以被測微生物rRNA中高度保守、物種特異性的片段序列作為鑒別微生物的標(biāo)志并設(shè)計(jì)合成熒光探針，通過被測微生物rRNA目標(biāo)特異性片段與合成熒光探針雜交反應(yīng)，使其熒光標(biāo)記和探針留在目標(biāo)微生物胞內(nèi)，激發(fā)出熒光信號，通過檢測熒光信號就能檢測出微生物在樣品中的種類及其含量[15]。曾景海等[16]采用FISH技術(shù)對勝利油田采油廠污水中SRPs進(jìn)行檢測，取得了顯著成效。

FISH技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是：檢測時(shí)間短(20 h)；靈敏度高，能計(jì)數(shù)單個(gè)細(xì)胞；能聯(lián)合計(jì)算機(jī)在線分析，避免了人工分析的誤差；檢測結(jié)果重復(fù)性好。缺點(diǎn)是：設(shè)備昂貴，成本高；需要專業(yè)的操作人員，不利于現(xiàn)場檢測。

3 結(jié)語

迄今為止，國內(nèi)外對SRB的檢測仍然沒有一種公認(rèn)為比較完善的方法。通過比較分析各種SRB檢測技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，為選擇更為有效的檢測方法提供了依據(jù)，也為完善檢測技術(shù)指明了方向。

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