鐘平生，梁廣文，曾 玲

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生態(tài)研究室，廣州 510642;2.惠州學(xué)院生命科學(xué)系，廣東 惠州 516007)

白背飛虱Sogatella furcifera(Horváth)是水稻上的重要遷飛性害蟲，長(zhǎng)期以來(lái)施用化學(xué)藥劑是控制稻飛虱最有效的途徑。但化學(xué)藥劑的長(zhǎng)期大量不合理使用導(dǎo)致害蟲對(duì)多種殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性 (梁天錫和毛立新，1996;姚洪渭等，2000;Endo and Tsurumachiw，2001;Wang et al.，2008a)。近年來(lái)，隨著水稻種植模式、品種結(jié)構(gòu)和氣候環(huán)境條件的改變 (侯再芬等，2007;陳仕高，2008;凌炎等，2009)，稻飛虱暴發(fā)頻率逐漸升高、發(fā)生面積逐年加大，危害程度不斷加重，給水稻的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅 (程家安和祝增榮，2006;李淑勇等，2009)。利用抗蟲品種是控制稻飛虱的有效措施 (丁克軍等，1993)，但如果大面積連續(xù)種植抗性基因單一的抗蟲品種，較易引起稻飛虱產(chǎn)生新生物型，使原來(lái)的抗蟲品種失去抗性 (黃所生等，2011)。為了深入了解珠三角地區(qū)水稻栽培品種對(duì)白背飛虱的抗性及抗原次生物質(zhì)對(duì)白背飛虱種群增長(zhǎng)的影響，探明不同抗原次生物質(zhì)組成、差異對(duì)白背飛虱的抑制機(jī)理，本文從抗感水稻品種的植株中提取次生物質(zhì)，應(yīng)用高效液相色譜 (HPLC)技術(shù)分析測(cè)試次生物質(zhì)的組成與含量，為探討水稻抗蟲性與抗原次生物質(zhì)之間的互作關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試品種:粵農(nóng)占、雙桂、粳秈89等品種由廣東省農(nóng)科院水稻所提供;小農(nóng)占、秈小占由江門市新會(huì)興業(yè)發(fā)展有限公司提供。

1.2 抗性品種樣品處理

將供試品種種子洗凈、催芽后播種在65 cm×45 cm×10 cm的苗箱內(nèi)，行距5 cm，行長(zhǎng)20 cm。每品種設(shè)3個(gè)重復(fù)，各品種隨機(jī)排列，放于網(wǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，并罩以大塑料紗養(yǎng)蟲籠防蟲 (60目)。待秧苗長(zhǎng)至3葉時(shí)，每品種采集5株健壯植株，剪碎、混勻，反復(fù)縮分后，稱取 (100.0±0.2)mg，用5 mL甲醇浸泡12 h，取其上層清液，待溶劑揮發(fā)干后，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇水溶液重新溶解，作為測(cè)試樣品，采用趙穎等 (2004)的方法測(cè)定稻株中抗原次生物質(zhì)。每樣品5次重復(fù)，各峰面積取其平均值以測(cè)定水稻植株的抗性次生物質(zhì)含量。

1.3 HPLC測(cè)定的色譜條件

樣品在HP1100高效液相色譜儀上采用C18反相柱 (Hypersil ODS 5 μm，410 mm×250 mm)，以1%乙酸水溶液 (A)和乙腈 (B)的混合溶劑為梯度洗脫的流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定。色譜條件參照Mattice等 (2001)和趙穎等 (2004)的方法，并對(duì)其方法略作改進(jìn)，將流動(dòng)相梯度調(diào)整為:在1.5 mL·min－1流速下，以8%B洗脫3 min后，在22 min內(nèi)提高到35%B，再在4 min內(nèi)繼續(xù)提高到80%B，最后在 11 min內(nèi)降回 8%B，共運(yùn)行40 min。進(jìn)樣量10 μL，紫外檢測(cè) OD320值。采集前30 min的色譜數(shù)據(jù)，確定相應(yīng)色譜峰的保留時(shí)間和面積積分。

1.4 數(shù)據(jù)分析

譜圖中保留10～19 min的13個(gè)譜峰的峰面積值用于數(shù)據(jù)分析，運(yùn)用主成分分析法 (PCA)對(duì)這13個(gè)譜峰進(jìn)行研究，以確定與抗白背飛虱有關(guān)的主要譜峰。同時(shí)將白背飛虱在抗性品種上的增長(zhǎng)指數(shù) (I)與這13個(gè)特征峰的峰面積值進(jìn)行多元回歸分析，以確定這些主要譜峰對(duì)水稻抗蟲性的相對(duì)貢獻(xiàn)，采用唐啟義等 (2007)的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。

1.5 水稻抗性品種對(duì)白背飛虱種群的抑制作用

本試驗(yàn)選擇在江門市新會(huì)區(qū)沙堆鎮(zhèn)廣東現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)示范區(qū)。選取面積約2000 m2左右的稻田劃分為5小區(qū)，分別種植抗感性不同的上述5個(gè)水稻品種。移栽后20 d開始調(diào)查白背飛虱種群的消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，直到水稻成熟為止，采用平行跳躍式取樣，每隔4天調(diào)查1次，每品種取5個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)取10叢，共調(diào)查50叢，記錄稻株上白背飛虱1～2齡若蟲、3～5齡若蟲和成蟲數(shù)量。與此同時(shí)，將帶卵稻株、3～5齡若蟲采回室內(nèi)飼養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)卵寄生與不孵數(shù)、3～5齡若蟲的寄生率。應(yīng)用龐雄飛 (1995)等方法，組建以作用因子組配的生命表，并利用干擾作用控制指數(shù) (The Interference Index of population control，IIPC)、排除作用控制指數(shù)(TheExclusion Indexofpopulation control，EIPC)評(píng)價(jià)抗性品種及其自然天敵對(duì)白背飛虱種群的控制作用，以此分析抗性品種對(duì)稻白背飛虱種群的控制效果與作用機(jī)理。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻品種抗性特征次生物質(zhì)與白背飛虱種群增長(zhǎng)指數(shù)的關(guān)系

在本研究色譜條件下，所測(cè)樣品的5個(gè)水稻品種在10～19 min內(nèi)均能檢測(cè)到分離較好的13個(gè)峰 (表1)。經(jīng)主成分分析，峰4、峰9與峰10對(duì)應(yīng)的組分對(duì)抗蟲性貢獻(xiàn)相對(duì)較大，可能是影響水稻對(duì)白背飛虱抗性水平的主要抗原次生物質(zhì)。將13個(gè)特征色譜峰面積與白背飛虱種群增長(zhǎng)指數(shù)(I)值進(jìn)行多元回歸分析，得到最優(yōu)回歸方程為Y=152.0762+0.7749X4－13.1806X9－14.4265X10，式中，Y為白背飛虱種群增長(zhǎng)指數(shù) (I)值，X4、X9、X10分別為峰4、峰9、峰10的峰面積值。經(jīng)各參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果表明，擬合的回歸方程中Y(I)與X4、X9、X10之間回歸極顯著 (r=0.9999，F(xiàn)=16277.0384，P=0.0058＜0.01);各回歸參數(shù)估計(jì)值的假設(shè)檢驗(yàn)結(jié)果也達(dá)差異極顯著，該模型能很好地?cái)M合次生物質(zhì)含量與白背飛虱種群增長(zhǎng)指數(shù) (I)之間的關(guān)系。

由模型可見，這些次生物質(zhì)對(duì)水稻抗性的貢獻(xiàn)有正有負(fù)。峰9、峰10對(duì)應(yīng)的次生物質(zhì)含量的增加將降低水稻對(duì)白背飛虱的增長(zhǎng)指數(shù)，即增強(qiáng)水稻的抗性;而峰4的作用則相反。次生物質(zhì)含量對(duì)水稻抗性水平的綜合影響以及相對(duì)貢獻(xiàn)率，都可以從模型中定量地反映出來(lái)，因此，可利用此模型間接鑒定和預(yù)測(cè)水稻品種對(duì)白背飛虱的抗性水平。

表1 水稻液相色譜特征峰值表Table 1 Rice liquid chromatographic peak form characteristics

2.2 抗性品種對(duì)白背飛虱種群的抑制作用

根據(jù)田間系統(tǒng)調(diào)查及同期室內(nèi)飼養(yǎng)獲得的寄生率數(shù)據(jù)，組建了早稻白背飛虱自然種群生命表(表2)。由表2可看出，不同抗性品種對(duì)白背飛虱大田種群的抑制作用不同。白背飛虱種群趨勢(shì)指數(shù) (I)在感蟲品種雙桂上第1代和第2代分別為4.008和7.432，均大于中感品種小農(nóng)占、秈小占以及中抗品種粳秈89的種群趨勢(shì)指數(shù)I值。以感蟲品種雙桂為參照，計(jì)算出各品種兩個(gè)世代的IIPC。結(jié)果表明，白背飛虱種群第一代在各品種初始密度相同的情況下，種群增長(zhǎng)指數(shù)差異不大，分別達(dá)對(duì)照品種雙桂的0.618～0.670倍;而在第二世代中，中抗品種粳秈89的IIPC為0.188;中感品種粵農(nóng)占、小農(nóng)占的IIPC為0.315、0.359?？梢娝究瓜x品種對(duì)白背飛虱第二世代種群數(shù)量消長(zhǎng)的影響是明顯的，即中抗品種可有效地抑制水稻生長(zhǎng)后期白背飛虱種群的增長(zhǎng)。同時(shí)，秈小占上白背飛虱I值已達(dá)0.465，表明其抗性具有一定程度的下降，也即抗白背飛虱的生物型可能已產(chǎn)生一定的轉(zhuǎn)變。

表2 早稻白背飛虱自然種群生命表Table2 The life table of natural population of WBPH on resistant varieties

2.3 不同水稻品種上天敵對(duì)白背飛虱種群的作用

在雙桂、秈小占、小農(nóng)占、粵農(nóng)占和粳秈89上，白背飛虱兩個(gè)世代種群趨勢(shì)指數(shù)I分別為29.789、9.280、6.603、6.030和 3.689，即白背飛虱經(jīng)過(guò)2個(gè)世代的生長(zhǎng)發(fā)育，種群將分別增長(zhǎng)29.789倍、9.280倍、6.603倍、6.030倍和3.689倍。換算成IIPC總值，中感品種秈小占、小農(nóng)占、粵農(nóng)占 IIPC總值分別為0.311、0.222、0.202，中抗品種粳秈89 IIPC總值為0.124。

同時(shí)，將捕食性天敵和寄生性天敵的作用合并，得到天敵類群對(duì)白背飛虱的排除作用控制指數(shù)EIPC(表3)。在表3可知，在中抗品種粳秈89上，捕食性天敵的EIPC為6.4392，在中感蟲品種粵農(nóng)占和秈小占上，EIPC分別為5.6689和5.3937，在感蟲品種雙桂上，EIPC為2.7956。表明捕食性天敵的捕食效能在中抗品種上最高，中感品種次之，感蟲品種上最弱。寄生性天敵作用不如“捕食性天敵”強(qiáng)，但同樣表現(xiàn)出這種相似變化趨勢(shì)，表明抗蟲品種對(duì)白背飛虱種群的抑制作用除了抗原次生物質(zhì)差異外，也反映在自然天敵類群作用的增強(qiáng)上。

表3 不同抗感性品種上天敵類群的作用Table 3 The effect of groups of enemies on WBPH

2.4 次生物質(zhì)特征峰總值與田間白背飛虱種群增長(zhǎng)的關(guān)系

雙桂、秈小占、小農(nóng)占、粵農(nóng)占、粳秈89液相色譜13個(gè)特征峰面積總值見圖1。表明抗蟲品種的色譜峰值之和大于感蟲品種的色譜峰值之和，如中抗品種粳秈89和中感品種秈小占的色譜峰值之和分別為35.6860和29.8994，表明水稻品種抗原次生物質(zhì)色譜峰面積的大小間接反映了水稻品種對(duì)白背飛虱種群的抗蟲水平。

圖1 水稻品種抗性特征次生化合物含量Fig.1 Rice varieties resistant characteristics material content

依據(jù)早稻白背飛虱種群增長(zhǎng)指數(shù)，大田白背飛虱種群的增長(zhǎng)趨勢(shì)指數(shù)與特征次生物質(zhì)色譜峰值的大小存在顯著相關(guān)性。建立的擬合的線性回歸方程為:Y=82.7086－2.3476X，相關(guān)系數(shù)R為0.9205，對(duì)回歸方程進(jìn)行檢驗(yàn)，F(xiàn)值為16.6585，P=0.0266(＜0.05)，達(dá)到顯著差異。

3 結(jié)論與討論

水稻的抗蟲性是多種特征次生物質(zhì)共同作用的結(jié)果，抗性特征色譜峰總值與白背飛虱種群增長(zhǎng)指數(shù)呈現(xiàn)極顯著的相關(guān)性，其中以峰4、峰9與峰10對(duì)白背飛虱種群的發(fā)生程度貢獻(xiàn)最大，3個(gè)次生物質(zhì)組分對(duì)水稻抗性的貢獻(xiàn)有正有負(fù)，貢獻(xiàn)的權(quán)重也是各不相同的，不能簡(jiǎn)單加和。由于液相色譜儀的檢測(cè)前處理簡(jiǎn)單，每一樣品分析運(yùn)行時(shí)間短，只需極少量的葉片組織，以不損害水稻植株的方式即可完成色譜峰值檢測(cè)和抗性鑒定。該方法可用于大量篩選含有抗原次生化合物的抗性品系，使雜交后代抗性植株的鑒定與篩選變得容易，大大縮短抗性品種的育種周期。為建立快速、簡(jiǎn)捷、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的水稻3葉期抗性鑒定方法提出了新途徑。因此，利用高效液相色譜技術(shù)與方法，可簡(jiǎn)捷、快速地測(cè)定大田白背飛虱種群在不同水稻品種上的發(fā)生動(dòng)態(tài)，即間接預(yù)測(cè)出水稻品種的抗蟲性。

目前在珠三角地區(qū)推廣種植的水稻品種對(duì)白背飛虱大多都表現(xiàn)感蟲，有些品種對(duì)白背飛虱的抗蟲性發(fā)生了改變，出現(xiàn)了新生物型，致使原先表現(xiàn)抗蟲的品種喪失抗性。鑒于白背飛虱生物型已發(fā)生改變，為防患于未然，應(yīng)對(duì)白背飛虱生物型的發(fā)生動(dòng)態(tài)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以了解珠三角地區(qū)白背飛虱生物型組成結(jié)構(gòu)，為抗白背飛虱育種和該蟲的可持續(xù)控制提供幫助。目前，白背飛虱主要以化學(xué)防治為主，過(guò)度依賴化學(xué)農(nóng)藥在生產(chǎn)帶來(lái)了諸多問(wèn)題，如防治成本上升、殺死害蟲天敵、害蟲產(chǎn)生抗藥性、稻田生境中有害物質(zhì)的殘留等(Heinrichand and Mochida，1984;Khan and Saxenal，1985;毛立新等，1992;王蔭長(zhǎng)等，1994;張內(nèi)河等，1996)。實(shí)踐證明，利用抗蟲品種是控制白背飛虱的安全、有效措施。因此，為更有效地控制白背飛虱，應(yīng)針對(duì)當(dāng)?shù)匕妆筹w虱田間種群生物型的組成結(jié)構(gòu)，加強(qiáng)抗蟲品種培育與推廣。

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