劉 勇，高 娜，朱 靈，李 飛，王貽坤，張 龍

（中國(guó)科學(xué)院安徽光學(xué)精密機(jī)械研究所光電子技術(shù)研究室，安徽合肥 230031）

0 引言

20世紀(jì)90年代初，Manz A和Widmer H M首次提出微型全分析系統(tǒng)（miniaturized total analysis systems）的概念［1］，其核心是微流控芯片，即以微機(jī)電系統(tǒng)（micro-electro-mechanical systems，MEMS）技術(shù)為依托，通過(guò)控制微通道中的流體將取樣、預(yù)處理、反應(yīng)、分離和檢測(cè)等操作集成在微芯片上進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)分析系統(tǒng)的微型化、集成化、自動(dòng)化與便攜化［2］。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是Mullis于1985年發(fā)明的一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。PCR的原理［3］類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，在試管中給DNA的體外合成提供模板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、Mg2+、合適的緩沖體系，進(jìn)行DNA模板的變性，引物與模板的退火和引物的延伸，經(jīng)過(guò)多次變性、退火和延伸后，待擴(kuò)增的DNA分子或者片斷可放大幾十甚至幾百萬(wàn)倍。

在PCR的熱循環(huán)中，溫度直接影響PCR擴(kuò)增成功與否，較大的溫度偏差會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增失敗:變性溫度太高會(huì)影響DNA聚合酶的活性;退火溫度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致大量非特異性產(chǎn)物出現(xiàn)，而過(guò)高又會(huì)使擴(kuò)增效率下降;不合適的延伸溫度也會(huì)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性、產(chǎn)量造成影響［3］。近年來(lái)研究表明［4］:提高PCR熱循環(huán)中3個(gè)溫區(qū)之間的升降溫速率，不僅能夠縮短整個(gè)PCR擴(kuò)增過(guò)程所需時(shí)間，而且特異性更好。微流控芯片為PCR微型化操作提供了一條可行的途徑，較小的反應(yīng)體積不僅可以大大減少試劑消耗還可提高升降溫速率。

1 微流控PCR裝置中加熱方式和冷卻方式

加熱和冷卻方式直接影響溫度的升降溫速率，決定了PCR擴(kuò)增所需的時(shí)間。

1.1 微流控PCR裝置中加熱方式

微流控PCR裝置中采用的加熱方式大致可分為接觸式和非接觸式加熱兩種。接觸式加熱是將加熱源直接與微芯片接觸，以傳導(dǎo)方式對(duì)反應(yīng)區(qū)域加熱?？刹捎闷霞傻谋∧ぜ訜嵩?，如鉑（Pt）、銦錫氧化物（Indium Tin Oxide，ITO）等;或外置加熱裝置，如金屬加熱塊、熱電制冷器（thermoelectric cooler，TEC）等。非接觸式加熱可采用紅外輻射加熱、感應(yīng)加熱、微波加熱等。

1.1.1 片上集成薄膜加熱元件

薄膜加熱元件具有體積小、溫度響應(yīng)速度快、控制精度高等優(yōu)勢(shì)，廣泛用于微流控PCR裝置中，目前多采用Pt薄膜［5～11］作為加熱元件，升溫速率主要在 10～20 ℃ /s。

此外，ITO也有很大優(yōu)勢(shì)，其薄膜厚度在nm數(shù)量級(jí)，物理化學(xué)性能穩(wěn)定，與大部分襯底有良好的附著性，另外，ITO薄膜的透光性較好，便于光學(xué)檢測(cè)。戴敬等人［12］采用ITO對(duì)連續(xù)流動(dòng)式芯片加熱，20～30 s后溫度上升到設(shè)定值達(dá)到穩(wěn)定。

1.1.2 外置加熱裝置

最簡(jiǎn)單的外置加熱裝置是利用電熱加熱器加熱銅［13］、鋁［14］等金屬塊。金屬塊作為外置加熱系統(tǒng)具有較大的體積和熱容量，升溫和冷卻速率較慢，從而限制了微反應(yīng)速度。

另外一種常用的外置加熱裝置是熱電制冷器，其溫度響應(yīng)快，變化范圍寬，均勻性好于線形的加熱源，具有較好的應(yīng)用前景［15］。采用單片TEC很難達(dá)到要求時(shí)，可以多片一起使用［16，17］。Qiu X B 等人［16］將 PCR 微芯片夾在兩片TEC之間，形成三明治結(jié)構(gòu)，該方法能較好地改善溫度梯度。如果只有單片TEC，PCR微芯片上下表面溫度相差2.5℃，如果采用兩片 TEC，溫度相差0.2℃。

1.1.3 紅外輻射加熱

紅外輻射的物理本質(zhì)是熱輻射，物體的溫度越高，輻射出來(lái)的紅外線越多，這些輻射能被其他物體接收后又可轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮苁蛊錅囟壬撸Ｓ玫募t外輻射源有鎢絲燈［18，19］、鹵鎢燈［20］等。通過(guò)控制紅外輻射波長(zhǎng)，采用對(duì)紅外輻射吸收較小的材料，選擇性地加熱反應(yīng)液，可以避免反應(yīng)腔熱容量的影響，提高升溫速率，但是需要增加透鏡、濾波片等光學(xué)器件。

1.1.4 感應(yīng)加熱

基于輻射加熱存在的能量效率不高、需要透鏡濾波片等光學(xué)器件的問(wèn)題，感應(yīng)加熱是一種新的有效的非接觸加熱方法。感應(yīng)加熱［21］單元一般包括電力發(fā)電機(jī)、由線圈組成的振蕩回路（儲(chǔ)能電路）和水冷卻系統(tǒng)，線圈的設(shè)計(jì)是感應(yīng)加熱方法中一個(gè)重要的問(wèn)題。在Pal D等人［22］設(shè)計(jì)的感應(yīng)加熱系統(tǒng)中包括2個(gè)線圈:線圈1由直徑2 mm的漆包銅線環(huán)繞在直徑10 mm的鐵氧體磁芯上組成，12 V的電池組提供直流電，交變電流由方波脈沖產(chǎn)生;線圈2是一個(gè)由金屬鐵制成的圓環(huán)形加熱器，外徑14mm，內(nèi)徑5mm，4塊PCR微芯片通過(guò)高溫粘結(jié)在金屬加熱器上，升溫速率為6.5℃/s，該方法裝置簡(jiǎn)單，低功耗，便于開發(fā)手?jǐn)y式設(shè)備。

1.1.5 微波加熱

Fermér C等人［23］首次介紹了微波加熱，文中提到微波加熱有如下特點(diǎn):沒(méi)有熱慣性，能量高度集中;溫度梯度小，能加速PCR反應(yīng);25個(gè)循環(huán)后DNA聚合酶仍有活性。Shaw K J等人［24］用銅塊做成微波腔，升溫速率能達(dá)到65℃/s。Shah J J等人［25］在微流體通道集成薄膜微波傳輸線對(duì)流體進(jìn)行加熱，通過(guò)調(diào)節(jié)微波的激發(fā)頻率即可改變微波的功率，從而控制溫度。此外，調(diào)整微波傳輸線的位置可以對(duì)區(qū)域選擇性加熱。

1.1.6 其他加熱方式

Guijt R M等人［26］利用濃硫酸溶于水放熱的原理來(lái)加熱，裝置簡(jiǎn)單，不需要額外的微機(jī)電加工過(guò)程，但是升溫速率較慢（1℃/s）。Shen K Y等人［27］通過(guò)柔性印刷電路技術(shù)制作了一種薄膜銅電阻加熱器，升溫速率為8℃/s，該方法裝置簡(jiǎn)單，輕便，低成本，低功耗，熱耗散能力強(qiáng)。

1.2 微流控PCR裝置中冷卻方式

微流控PCR裝置中冷卻方式可采用自然對(duì)流或強(qiáng)制對(duì) 流，其 中 強(qiáng) 制 對(duì) 流 可 外 接 壓 縮 空 氣 源［24，25］或 風(fēng)扇［5，8，9，14，19，20，27，29］，對(duì)較小的加熱區(qū)域外接壓縮空氣源冷卻效果比風(fēng)扇好。強(qiáng)制對(duì)流方式冷卻速率較大，但是因?yàn)橥饨又评湎到y(tǒng)會(huì)增加體積，集成化的程度較低。自然對(duì)流無(wú)需外界提供動(dòng)力源，集成化程度較高，但速率比較低，還受周圍溫度的影響。Guijt R M等人［26］利用物理方法來(lái)制冷，通過(guò)丙酮蒸發(fā)吸熱將熱量帶走，冷卻速率較慢（1℃/s）。

2 微流控PCR裝置中溫度的測(cè)量方式

2.1 接觸式測(cè)溫

使測(cè)量體與被測(cè)介質(zhì)接觸、依靠傳熱或?qū)α鬟M(jìn)行熱交換并達(dá)到熱量平衡的測(cè)溫方法稱為接觸式測(cè)溫方法。接觸式測(cè)溫元件可以分薄膜型和非薄膜型測(cè)溫元件，薄膜型傳感器常和加熱器合二為一，集成在PCR微芯片上，主要是Pt［5，7，9，10，11］，Pt電阻的阻值與溫度呈近似線性關(guān)系，可以直接有效地對(duì)器件的溫度進(jìn)行測(cè)量。非薄膜型測(cè)溫元件種類較多，其中應(yīng)用較多的是熱電偶［14，16，22，24］。接觸式測(cè)溫主要優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)單，可靠，測(cè)量精度較高。但是測(cè)溫元件與被測(cè)反應(yīng)液直接接觸，會(huì)造成交叉污染。若與反應(yīng)腔接觸，又不能反映微流體內(nèi)局部溫度變化。此外，測(cè)溫需經(jīng)歷熱量的交換與平衡過(guò)程，會(huì)導(dǎo)致測(cè)溫過(guò)程的延遲，也會(huì)將測(cè)溫元件的熱容量添加到其中，影響其溫度。

2.2 非接觸式測(cè)溫

為了克服接觸式測(cè)溫遇到的問(wèn)題，一些研究者嘗試去開發(fā)非接觸式測(cè)溫的方法，如紅外輻射溫度計(jì)［19］。紅外輻射測(cè)溫不需要任何傳遞媒介、不需要直接接觸即可測(cè)溫，測(cè)溫速度快且不會(huì)對(duì)被測(cè)物產(chǎn)生大的干擾。其缺點(diǎn)是容易受外界因素的干擾，導(dǎo)致測(cè)量誤差大，且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，價(jià)格昂貴。

以上的方法都只能反映局部溫度，不能觀察溫度的空間分布情況，為了獲得空間的實(shí)時(shí)的溫度分布信息，又出現(xiàn)了其他新的方法，如熱致變色液晶（thermochromic liquid crystal，TLC）測(cè)溫技術(shù)［9］、指示劑熒光強(qiáng)度變化測(cè)溫技術(shù)［12，18，25，29，30］，將 TLC 或指示劑添加到 PCR 反應(yīng)液中，由溫度變化導(dǎo)致的TLC顏色的變化或熒光強(qiáng)度的變化可以反映整個(gè)PCR反應(yīng)腔內(nèi)的溫度情況。

3 結(jié)論

綜上所述，接觸式加熱體積小，集成化程度高，容易實(shí)現(xiàn)微型化和便攜化，但添加了額外的熱容量，不利于熱循環(huán)的快速進(jìn)行;非接觸式加熱克服了接觸式加熱的主要缺點(diǎn)，加熱元件的熱容量不再參加PCR反應(yīng)體系的溫度循環(huán)，升溫度速率一般要優(yōu)于接觸式加熱，但非接觸式加熱的設(shè)備一般比較大，相對(duì)復(fù)雜，價(jià)格昂貴。采用自然冷卻不需要任何外置設(shè)備，但是冷卻速率較慢，通常還是外接風(fēng)扇或是壓縮空氣源強(qiáng)制對(duì)流來(lái)加快冷卻。接觸式測(cè)溫雖然簡(jiǎn)單可靠，但并不能實(shí)時(shí)反映被測(cè)介質(zhì)的溫度，也不能反映整個(gè)區(qū)域的溫度分布情況。通過(guò)添加TLC或熒光染料，找到其與溫度的相關(guān)性，將測(cè)溫轉(zhuǎn)換為觀察TLC的顏色或測(cè)熒光染料的熒光強(qiáng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)，能實(shí)時(shí)反映溫度的空間分布和隨時(shí)間的變化率，為溫度的測(cè)量提供了一種很好的方法。

從集成化、微型化、便攜化的角度來(lái)看，更多的還是采用集成薄膜元件來(lái)加熱和測(cè)溫，常將Pt薄膜集成在PCR微芯片底部，集加熱和測(cè)溫于一體。

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