陶萬銀，張 巖，鐘 勁

HCV 屬于黃病毒科，是一種有包膜的正鏈RNA病毒。HCV 感染人肝細胞，導(dǎo)致慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝癌。目前尚無疫苗可供預(yù)防。治療慢性丙型肝炎（丙肝）的標準方案為長效干擾素聯(lián)合利巴韋林，療效還有待提高。

HCV 的實驗動物模型不僅是HCV 免疫學(xué)、病理學(xué)和病毒學(xué)等基礎(chǔ)科學(xué)的重要研究手段，還為HCV 疫苗和創(chuàng)新藥物的研發(fā)提供了關(guān)鍵的工具和平臺。HCV 有著高度的宿主特異性，人類是目前發(fā)現(xiàn)的HCV 的唯一宿主。HCV 不能感染有著完善的遺傳學(xué)操作工具的模式實驗動物，如小鼠、大鼠等。通過實驗接種，黑猩猩可以被HCV 感染，而且疾病的發(fā)生和發(fā)展與人類感染HCV 有著一定的相似性，因此長期以來黑猩猩一直是HCV 研究的唯一動物模型。但是黑猩猩作為瀕臨滅絕的靈長類動物，其在科研中的使用在動物倫理學(xué)上有著很大的爭議。加之黑猩猩的實驗使用成本非常昂貴，世界上僅有少數(shù)實驗室能最終使用黑猩猩，因此開發(fā)經(jīng)濟實用的HCV 小動物模型十分迫切。最近幾年，利用樹鼩和人源化小鼠建立HCV 的小動物模型有了良好的進展。本文介紹常用的幾種HCV 實驗動物模型的發(fā)展和應(yīng)用。

1 HCV 感染的黑猩猩模型

黑猩猩基因組約98%與人類相同，是目前已知的除人類外唯一可以被HCV 感染的靈長類動物，在HCV 研究發(fā)展進程中起到了不可替代的作用。20 世紀70年代中后期，臨床上發(fā)現(xiàn)了一種不同于當時已知的甲型肝炎和乙型肝炎的新型肝炎，稱為非甲非乙型肝炎。用此類患者血制品感染黑猩猩，也能發(fā)展成肝炎，最終確定這種肝炎是一種新病毒導(dǎo)致的。第一個HCV 序列正是從感染的黑猩猩血漿中提取的核酸中鑒定出來的[1]。第一個具有感染性的HCV cDNA 克隆也是在黑猩猩中驗證的，將體外轉(zhuǎn)錄制備的HCV RNA 注射到黑猩猩肝臟中，最終使黑猩猩感染了病毒[2-3]。

黑猩猩作為HCV 研究的動物模型有著如下優(yōu)勢：①研究HCV 的急性感染。HCV 患者在感染的急性期癥狀大多很輕微，等確診時往往已經(jīng)發(fā)展為慢性感染，因此很難在人群中進行HCV 急性期感染的研究。而黑猩猩作為實驗動物，可以用來研究在急性期內(nèi)HCV 的病毒學(xué)變化和宿主的免疫反應(yīng)。②黑猩猩在HCV 感染進程、病理學(xué)和免疫反應(yīng)方面與人類比較類似，是研究HCV 自然感染的理想對象[4]。③由于擁有與人類高度相似的免疫系統(tǒng)，黑猩猩可用于HCV 疫苗的研發(fā)。

2 HCV 感染的樹鼩模型

樹鼩是我國西南地區(qū)及東南亞地區(qū)常見的一種小動物，體型比大鼠略小，曾被歸為食蟲目或靈長目，后被劃分為獨立的樹鼩目。樹鼩在進化上較小鼠更接近人類，可用于多種人類疾病模型的研究，如HBV 感染[5]。HCV 感染樹鼩也有報道[6-7]，在Xie等[6]報道中，接種丙肝患者血漿后20%～35%的樹鼩血漿中HCV RNA 含量可達約104IU/ml。最近Amako等[8]報道了令人欣喜的進展，使用基因1b 型患者的血漿或者細胞培養(yǎng)獲得的病毒，在樹鼩中建立了HCV的持續(xù)性感染，并觀察到肝纖維化和肝癌等病變。在為期3年的感染實驗中，血漿中的HCV RNA 在一些時間點可以被檢測到；測定擴增出的HCV 非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural protein,NS）5A 區(qū)域序列后發(fā)現(xiàn)了變異；樹鼩陽性血漿再感染新的樹鼩時同樣可以建立感染，確定了接種病毒在樹鼩體內(nèi)的持續(xù)復(fù)制。3年后感染樹鼩的肝臟中依然可以檢測到低水平的HCV RNA，并且發(fā)生了組織纖維化和癌變。這是首次報道HCV 感染樹鼩引起的肝纖維化和肝癌。

目前樹鼩在HCV 研究中的應(yīng)用還沒有得到推廣，主要有2 個原因：①樹鼩在飼養(yǎng)繁殖環(huán)節(jié)、遺傳背景品系和遺傳工程操作上還達不到一個模型動物的要求；②HCV 感染樹鼩的現(xiàn)象還須要更多獨立實驗室的重復(fù)。根據(jù)現(xiàn)有的報道來看，HCV 感染樹鼩的陽性率仍然不高，而且HCV RNA 在樹鼩血漿中的水平通常比在患者血漿中低2～3 個數(shù)量級，說明樹鼩不是HCV 感染的最佳宿主。Tong 等[9]報道了在缺少某一種受體的細胞中過度表達人或者樹鼩的HCV 受體分子可以同樣有效地支持HCV 假病毒的侵入，表明樹鼩受體分子同樣可以有效地支持HCV 侵入宿主細胞。如果侵入樹鼩肝細胞不受阻礙，那么有可能是樹鼩肝細胞缺少了某種人類特異的可支持HCV 復(fù)制的宿主因子，或者樹鼩細胞的免疫反應(yīng)限制了HCV 的復(fù)制。如何克服這些種屬間的差異，建立高效的樹鼩感染模型是最終決定樹鼩能否成為研究HCV 的實驗動物模型的關(guān)鍵。

3 用于HCV 研究的小鼠模型

小鼠是目前使用最廣泛的實驗動物之一，實驗成本低，遺傳背景清楚，研究手段豐富，然而自然狀態(tài)下小鼠并不能被HCV 感染。在過去的十年里，研究人員通過各種手段改造小鼠，使小鼠成功感染HCV。目前有3 種用于HCV 研究的小鼠模型：①表達HCV編碼蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠；②含有來源于人體組織或細胞的嵌合型小鼠（或稱人源化小鼠）；③表達人源HCV 宿主因子的轉(zhuǎn)基因小鼠。以下分別介紹這3種模型的特點。

3.1 表達HCV 編碼蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠模型 早期的HCV 小鼠模型通常是用轉(zhuǎn)基因方法，將HCV 全長基因組或者表達特定蛋白的基因組片段整合到小鼠基因組中，構(gòu)建持續(xù)性表達HCV 蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠。Moriya 等[10]在2 種不同品系的小鼠中用HBV的啟動子控制表達HCV 的核心蛋白，出生16 個月后約1/3 的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生了肝癌。這表明HCV核心蛋白具有誘導(dǎo)肝細胞癌變的能力。這種模型的局限性是轉(zhuǎn)基因小鼠中的HCV 蛋白通常會過度表達，而且HCV 基因片段是隨機整合到小鼠基因組中的，有可能造成額外的影響。另外，此種小鼠模型缺乏HCV 侵入細胞和在細胞中復(fù)制的過程，因此其應(yīng)用非常有限。

3.2 含有來源于人體組織或細胞的嵌合型小鼠模型 Mercer 等[11]最早報道了一種含有人肝細胞的嵌合型小鼠可以被HCV 感染。在嚴重聯(lián)合免疫缺陷型（severe combined immunodeficiency,SCID）小鼠中，引入白蛋白啟動子控制尿激酶型纖溶酶原激活基因（urokinase-type plasminogen-activator gene,uPA）的表達，其肝臟特異表達的uPA 將造成持續(xù)性的小鼠肝損傷，這時候?qū)⑷说母渭毎浦驳叫∈笾?，即可建立人肝嵌合型小鼠模型。用丙肝患者血清感染這種嵌合型小鼠，約75%的小鼠感染后血漿中可檢測到HCV RNA 水平為3×（104～106）copies/ml，并持續(xù)存在15～35 周。這是HCV 小鼠模型的一次重要突破。該模型已被用于HCV 病毒進化[12]和抗病毒藥物開發(fā)[13]等多方面的研究。

通常在uPA-SCID 嵌合型小鼠中人肝細胞比例僅為15%[14]。由于uPA 造成的肝損傷，uPA-SCID小鼠很難飼養(yǎng)，而且移植手術(shù)必須在小鼠出生后2 周內(nèi)完成。最近報道了更加高效的嵌合模型Fah-/-Rag2-/-Il2rg-/-（FRG 小鼠）[15-16]。延胡索酰乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydroxylase,FAH）是酪氨酸代謝途徑最后一個酶，F(xiàn)AH 缺失造成有毒代謝產(chǎn)物的積累，從而引起小鼠肝損傷。使用2-（2-nitro-4-trifluoromethylbenzyol）-cyclohexane-1,3-dione（NTBC）處理可以阻斷有毒代謝產(chǎn)物積累，維持小鼠肝細胞正常功能[17]。FRG 小鼠正常飼養(yǎng)時加入NTBC，須要移植外源細胞時停止給藥即可，因此更易于飼養(yǎng)和移植，而且嵌合肝臟中人肝細胞所占比例最高可達到95%[18]。使用HCV 感染者血漿或細胞培養(yǎng)的病毒均可以感染FRG 小鼠，HCV RNA 最高可以達到107copies/ml[18]。但FRG 小鼠依然是免疫缺陷的，不能用于研究宿主對HCV 感染的免疫反應(yīng)、HCV 發(fā)病機制和疫苗的研發(fā)等工作。此外，人肝細胞供體來源于人成體肝組織，存在個體間差異，來源也受到一定的限制。這些都是該模型更廣泛應(yīng)用所須要克服的障礙。近年來干細胞技術(shù)發(fā)展很快，已有報道將人的誘導(dǎo)多能干細胞（induced pluripotent stem cells,iPS）分化成具有功能的肝細胞[19-20]，而且體外實驗證明這種來源的肝細胞可以被HCV 感染[21-22]。如果iPS 來源的肝細胞最終能代替成體肝組織成為FRG 小鼠的供體，將會極大地促進該模型的實際應(yīng)用。

最近Washburn 等[23]報道了同時具備人肝細胞和免疫細胞的HCV 小鼠模型。在免疫缺陷型的Balb/C Rag2-/-Il2rg-/-小鼠中，白蛋白啟動子控制FK506結(jié)合蛋白與caspase 8 融合蛋白特異性在小鼠肝細胞中表達，造成可誘導(dǎo)性肝細胞損傷，誘導(dǎo)后可接受人源肝細胞移植。在該小鼠中同時移植來源于胎肝組織的人肝母細胞和人造血干細胞，可以發(fā)育出成熟的人肝細胞和淋巴細胞。在感染HCV 的人源化小鼠肝臟中可檢測到HCV RNA，同時還能檢測到HCV 特異性T 細胞應(yīng)答反應(yīng)、肝星狀細胞的活化和肝纖維化相關(guān)基因的表達。最終約50%的人源化小鼠中出現(xiàn)肝纖維化癥狀，這也是首次報道HCV在小鼠感染模型中可以導(dǎo)致肝細胞纖維化。這一模型在研究HCV 感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)和發(fā)病機制方面將有廣泛的用途。遺憾的是，該模型小鼠的血漿中檢測不到HCV RNA，這或許是由于人的肝母細胞在小鼠中發(fā)育出的肝細胞功能不完全，還不能高效支持HCV 的復(fù)制。進一步優(yōu)化這種同時具備人肝細胞和免疫細胞的小鼠模型將是本領(lǐng)域發(fā)展的重點之一。

3.3 表達人源HCV 宿主因子的轉(zhuǎn)基因小鼠模型 構(gòu)建HCV 小鼠模型的另外一種嘗試是通過基因改造，將HCV 感染所必需的人源宿主因子轉(zhuǎn)到小鼠基因組中，使其可以支持HCV 感染。HCV 侵入細胞的受體分子CD81、SR-B1、Cluandin-1 和Occludin[24-27]已經(jīng)陸續(xù)被鑒定出來，HCV 假病毒和細胞培養(yǎng)來源的真病毒可以侵入同時表達這4 種人源受體分子的小鼠細胞[26]。但是Hikosaka 等[28]發(fā)現(xiàn)同時含有這4 種人源受體分子的轉(zhuǎn)基因小鼠卻依然不能被HCV 感染。這或許是由于小鼠肝細胞不能有效支持HCV 復(fù)制，導(dǎo)致常規(guī)手段檢測不到HCV 的感染。Rice 研究組報道了更加靈敏的小鼠模型[29]。他們用腺病毒載體，將人的CD81、SR-B1、Cluaudin-1 和Occludin 基因同時轉(zhuǎn)入熒光素工具小鼠的肝細胞中表達。熒光素工具小鼠的啟動子和編碼區(qū)之間存在終止序列，該序列兩端含有l(wèi)oxp 位點，當有Cre重組酶存在時，可識別并剪接掉loxp 之間的終止序列，從而激活熒光素基因的表達。同時，他們在HCV基因組上加入Cre 基因（HCV-Cre），然后感染上述小鼠。HCV 是正鏈RNA 病毒，其基因組本身可作為mRNA 直接翻譯蛋白，因此HCV-Cre 進入細胞后不須要復(fù)制即可表達Cre 蛋白。實驗結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)入受體分子的對照組小鼠相比，HCV-Cre 病毒感染后可以檢測到肝細胞中熒光酶活性顯著提高。研究者還利用該模型驗證了HCV 特異性中和抗體在體內(nèi)感染的保護效果，發(fā)現(xiàn)用包膜蛋白疫苗免疫后的小鼠與對照組相比，感染HCV-Cre 病毒后熒光素酶活性顯著下降，顯示了疫苗的保護作用。這一小鼠感染模型使用了免疫系統(tǒng)正常的小鼠，并巧妙地避開了小鼠在HCV 復(fù)制環(huán)節(jié)可能存在的缺陷，為HCV 中和抗體測試和疫苗的研發(fā)提供了有效的研究工具。

該小鼠模型仍然不支持HCV 的復(fù)制和包裝。這可能是由于小鼠肝細胞中缺少了某種必需的人源因子，也可能是由于小鼠肝細胞中存在某種限制性因子。Long 等[30]的研究結(jié)果表明，小鼠肝細胞中并不存在阻礙HCV 組裝和釋放的限制性因素，更有可能的是小鼠肝細胞中缺少了某種人肝細胞中特有的支持HCV 復(fù)制的分子，也可能是HCV 不能有效地阻斷小鼠的宿主免疫反應(yīng)，比如NS3 對小鼠線粒體抗病毒信號蛋白的切割[31]。如何鑒定出關(guān)鍵的人源宿主因子，解決HCV 在小鼠肝細胞中復(fù)制的障礙，將是下一步關(guān)注的問題。

4 總結(jié)與展望

實驗動物模型是研究HCV 病毒學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)、藥物和疫苗研發(fā)中重要的手段。由于與人類的高度相似性，黑猩猩作為HCV 的動物模型具有無與倫比的優(yōu)勢。但出于價格、道德倫理等方面的考慮，黑猩猩的使用正受到越來越多的限制。在其他動物模型中，小鼠模型應(yīng)用最廣泛，發(fā)展最快。盡管技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)能在免疫缺陷小鼠上同時移植人的肝細胞和造血干細胞及胸腺組織，但人源化嵌合型小鼠模型仍有許多問題有待解決，如嵌合型小鼠的肝臟非實質(zhì)細胞仍然是鼠源的，部分人源造血免疫細胞如B 淋巴細胞等在小鼠體內(nèi)的發(fā)育仍有障礙。這些缺陷限制了該模型在HCV 發(fā)病機制研究上的應(yīng)用，近年來發(fā)展迅速的成體干細胞分化研究將有可能推動人源化小鼠模型的完善和優(yōu)化。表達人源HCV 宿主因子的轉(zhuǎn)基因小鼠模型代表了小鼠模型的另外一個重要方向。盡管目前的HCV受體轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)可以支持HCV 的侵入，但在復(fù)制和病毒組裝分泌上還有缺陷，仍有待發(fā)現(xiàn)更多的在這兩個環(huán)節(jié)起關(guān)鍵作用的人源宿主因子。HCV 樹鼩模型目前還不夠穩(wěn)定，尚不能建立高效的、重復(fù)性好的感染。但考慮到其在進化上比小鼠更接近人類，加之我國在樹鼩資源和飼養(yǎng)繁殖上的優(yōu)勢，因此我國應(yīng)該積極探索發(fā)展HCV 樹鼩模型。

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