金 弘，劉婷婷，陳英華，劉 勇，孫曉偉

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040;2．黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱150040)

痛風是由尿酸鈉結晶(MSUC)沉積在關節(jié)周圍而引起的一種炎癥，臨床以關節(jié)劇痛伴腫脹發(fā)熱暗紅為主要表現的急性痛風性關節(jié)炎是痛風最常見的首發(fā)癥狀，亦是痛風的最基本的類型，典型發(fā)作一般多起病急驟，有時呈爆發(fā)性，多于午夜足痛驚醒，其疼痛性質為刀割、咬噬樣，關節(jié)及周圍組織紅、腫、熱、痛，是由于體內的嘌呤代謝紊亂所致的尿酸升高或排泄減少致尿酸鈉或尿酸結晶從超飽和的細胞外液沉積于組織所致的急性炎癥反應［1～3］。為此，本研究以急性痛風性關節(jié)炎大鼠為研究對象，對比觀察電針的不同波形對實驗性大鼠急性痛風性關節(jié)炎滑膜組織中HSP70表達的影響，以篩選出臨床療效更佳的電針治療方法。

1 材料與方法

1．1 實驗動物分組及處理

清潔級雄性Wistar大鼠120只，體重(255±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供(合格證號:黑動字第P00102005)。常規(guī)飼養(yǎng)1周后，將120只Wistar大鼠隨機分為5組，即空白組、模型組、電針疏波組、電針疏密波組、電針密波組，每組24只。

1．2 尿酸鈉溶液的制備

1 250 mg尿酸鈉晶體加45 ml生理鹽水，再加5 ml吐溫－80(失水山梨醇脂肪酸酯聚氧乙烯醚－80)，加熱攪拌，配成50 ml尿酸鈉溶液。

1．3 造模方法

模型制作按Coderre等經典方法略作改進，即用6號注射針從受試大鼠右后肢踝關節(jié)背側，以45°方向插入脛骨肌腱內側，將0.2 ml尿酸鈉溶液注入到踝關節(jié)腔，復制急性痛風性關節(jié)炎模型。

1．4 針刺方法

各組動物分為1天、3天、5天3個時間點，每個時間點觀察8只，分別于實驗第1天造模，造模3 h后開始進行干預。

針具:0．25 mm×13 mm華佗牌無菌針灸針。取穴:病變側足三里、三陰交，穴位選取依據《實驗針灸學》的動物穴位圖譜，并以比較解剖和骨度分寸法為依據模擬定位［4］。

針刺方法:空白組:不造模，不治療;模型組:造模3 h后開始，每天與其它治療組動物同樣方法固定1次，每次20 min，連續(xù)5天;電針疏波組:將大鼠固定在特制的鼠架上，直刺“足三里”、“三陰交”，使其針感傳導，令“足三里”、“三陰交”構成回路，然后連接SDZII型電針儀，正極在上，負極在下，選用疏波刺激，頻率為2 Hz，電壓為2 V，強度以見大鼠下肢肌肉收縮引起肢體輕微顫動為宜，每天1次，留針20 min，連續(xù)5天;電針密波組:同電針疏波組，但選用密波刺激，頻率為100 Hz，電壓為2 V，強度以見大鼠下肢肌肉收縮引起肢體輕微顫動為宜，每天1次，留針20 min，連續(xù)5天;電針疏密波組:同電針疏波組，頻率為2 Hz/100 Hz，電壓為2 V，強度以見大鼠下肢肌肉收縮引起肢體輕微顫動為宜，每年1次，留針20 min，連續(xù)5天。

1．5 采用PV免疫組化兩步法檢測滑膜細胞HSP70表達

①切片常規(guī)脫蠟到水;②3%H2O2中孵育10 min，PBS沖洗2 min 3次;③微波修復:切片入枸椽酸鹽緩沖液(PH6)，微波爐中5 min 2次，中間間隔10 min。自然冷卻至室溫;④滴加一抗，4℃冰箱中過夜，PBS沖洗2 min 3次;⑤滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗2 min 3次;⑥DAB顯色5～10 min，蒸餾水充分沖洗;⑦蘇木素復染1 min;⑧常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1．6 數據統(tǒng)計方法

所有數據均采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用One－Way ANOAY方差分析，組間比較選用LSD及S－N－K分析。文中數據用均數±標準差(±s)表示。

2 結果

MSUC混懸液注射后，模型組與空白組比較HSP70表達增強，經過治療，電針各組HSP70蛋白表達進一步升高，與模型組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，說明電針各組均能上調急性痛風性關節(jié)炎大鼠HSP70含量。治療各時間點，電針疏波組與電針密波組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);電針治療第3、5天，電針疏密波組與電針疏波組及電針密波組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。提示電針疏密波組對上調急性痛風性關節(jié)炎大鼠HSP70蛋白含量的作用優(yōu)于電針疏波組及電針密波組。詳見表1。

表1 各組大鼠踝關節(jié)滑膜組織中HSP70表達的變化(平均灰度值，±s)

表1 各組大鼠踝關節(jié)滑膜組織中HSP70表達的變化(平均灰度值，±s)

注:與空白組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較，☆P＜0.05;☆☆P＜0.01;與電針疏波組比較，▲P＜0.05;與電針密波組比較，★P＜0.05。

組別 動物(只) 1天 3天 5天147．63 ±29．55 148．14 ±28．36 148．5 ±31．04模型組 8 157．00 ±25．12* 159．75 ±27．85* 163．5 ±29．88＊＊電針疏波組 8 161．25±26．47＊＊☆ 163．88±29．23＊＊☆ 169．88±32．94＊＊☆電針密波組 8 163．13±28．15＊＊☆ 164．88±33．64＊＊☆ 170．13±34．27＊＊☆電針疏密波組 8 163．15±28．97＊＊☆ 172．25±32．82＊＊☆▲★ 181．75±35．38空白組8＊＊☆☆▲★

3 討論

痛風性關節(jié)炎是尿酸鈉鹽結晶引起的炎癥反應。熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)又稱“應激蛋白”，是生物體在不利因素下誘導基因開放而合成的一組新蛋白質，對維持細胞的正常狀態(tài)及功能有重要作用。HSP還是一種強烈的免疫原性分子，具有調節(jié)自身免疫過程的能力［5］?，F在普遍認為HSP70這種廣泛存在、進化上高度保守的“分子伴侶”是細胞保護的物質基礎，其在應激狀態(tài)下，可以增強細胞對損害的耐受程度，維持細胞的正常功能代謝，提高細胞生存率［6］，保護細胞生命活動及蛋白質以維持細胞生命;參與免疫調節(jié)，能保護細胞對抗TNF和內毒素的損傷，還可引起宿主的抗感染免疫;在炎癥反應中，具有保護組織避免受活性氧因子誘導的DNA鏈斷裂，類脂過氧化和保護線粒體結構，因此在炎癥免疫性疾病中，HSP70在免疫方面發(fā)揮著重要的功能。

本實驗研究發(fā)現，正常大鼠踝關節(jié)局部組織僅見少量的HSP70蛋白表達，而急性痛風性關節(jié)炎大鼠HSP70蛋白表達增高，這可能與炎癥細胞因子的刺激有關，是機體產生的一種自我保護反應。電針可促進急性痛風性關節(jié)炎大鼠局部組織大量表達HSP70蛋白，提示電針作為一種生理性適宜刺激(瞬間高溫)誘導體內具有細胞保護作用的HSP70大量合成，可能是其治療急性痛風性關節(jié)炎的重要作用途徑之一。

上述結果可以看出電針各組均有上調HSP70蛋白表達的作用，電針疏波組和電針密波組作用相似，而電針疏密波組優(yōu)于電針疏波組和電針密波組。它為探討針灸效應的機理研究提供了新的重要線索，毫無疑問，電針誘導HSPs的合成，從而對機體產生保護作用，可能是針灸效應的重要機制之一，有必要在此領域進行深入系統(tǒng)的研究。

電針療法是傳統(tǒng)針刺與現代電針儀相結合應用的一種療法，電針可起到補腎益精、舒筋通絡、消腫止痛的作用，其治療作用具有多層面、多途徑、多靶點的作用特點，經過中樞的整合后可有效的調控信號轉導通路來調節(jié)機體的免疫應答以及細胞的增殖、分化及凋亡，從而能有效減輕患者的臨床癥狀［7］。臨床研究中發(fā)現，電針疏通經絡氣血運行，從整體上雙向調節(jié)細胞免疫和體液免疫，有效地治療痛風性關節(jié)炎。實驗針灸學亦證實電針能廣泛地激活神經、內分泌系統(tǒng)，調節(jié)實驗動物免疫功能，達到止痛、消腫、改善關節(jié)功能的目的。其次，電針儀制造技術成熟、各項參數穩(wěn)定，可保障實驗過程中條件的統(tǒng)一性和可重復性，使實驗數據更客觀、準確。本實驗中選用的華佗牌SDZ－II電針儀因其性能穩(wěn)定和良好的治療作用，在針刺研究中已被眾多研究者所采用。

電針治療本病取足三里、三陰交二穴相配，一陰一陽，可以鼓舞正氣、補益氣血、健脾和胃、祛濕化痰，從而使氣血運行暢通，濕熱之邪隨之排出體外。以上二穴合用，能夠激發(fā)經氣，活血通絡，祛邪外出，共奏標本同治之功。通過以上試驗，電針足三里、三陰交穴后，對實驗動物起到消腫止痛、扶正祛邪的治療作用。從細胞和分子水平使失衡的免疫系統(tǒng)及神經內分泌網絡趨于穩(wěn)定。電針具有很好的抗炎止痛效果，使用電針增強腧穴刺激，通過神經傳導提高機體痛閾，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應，減少了癥狀“反跳”的發(fā)生。總之，電針對急性痛風性關節(jié)炎有很好的療效，具有療效好、不良反應少的優(yōu)點，為臨床中西醫(yī)結合綜合療法治療急性痛風性關節(jié)炎提供了一種新方法，值得推廣。

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