劉淑芹，吳鳳芝，劉守偉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

20世紀(jì)80年代以來，隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，園藝作物的研究已經(jīng)不僅僅局限于采用傳統(tǒng)的田間數(shù)據(jù)測(cè)量、植株病蟲害調(diào)查、雜交授粉等方法，分子生物學(xué)研究方法逐漸被研究者廣泛應(yīng)用，其中分子標(biāo)記技術(shù)在園藝作物研究中發(fā)展十分迅速。近年來，DNA分子標(biāo)記技術(shù)就已廣泛地應(yīng)用于園藝作物的遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、品種純度鑒定及分子標(biāo)記輔助育種等方面，如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）、微衛(wèi)星（Microsatellite）和擴(kuò)增限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)分析（AFLP）等[1-4]。每種分子標(biāo)記方法各有優(yōu)點(diǎn)，但都有其局限性。RAPD技術(shù)的引物是隨機(jī)序列，操作十分簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)，但可重復(fù)性不夠理想；AFLP技術(shù)的多態(tài)性和重復(fù)性都不錯(cuò)，但對(duì)實(shí)驗(yàn)器材和技術(shù)要求稍高，較為復(fù)雜和花費(fèi)更多；SSR技術(shù)擁有高度特異性和豐富多態(tài)性并且為共顯性標(biāo)記，但它需要預(yù)先知道基因組的序列來設(shè)計(jì)引物，因此限制了它的應(yīng)用范圍；ISSR技術(shù)的出現(xiàn)克服了這些局限性，并很快被運(yùn)用到許多植物研究領(lǐng)域[5-6]。

ISSR（Inter-simple sequence repeat）是近年來在微衛(wèi)星技術(shù)上發(fā)展起來的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)[5,7]。由于ISSR技術(shù)不僅可以快速、高效和靈敏地檢測(cè)出基因組DNA的多態(tài)性，有很好的重復(fù)性，而且操作簡(jiǎn)單、成本較低，適合大樣本的檢測(cè)，在種群遺傳學(xué)、種質(zhì)資源、分類學(xué)與種系發(fā)生學(xué)等方面得到迅速應(yīng)用[8-10]。本文主要對(duì)ISSR標(biāo)記的原理、方法、特點(diǎn)及其在園藝作物研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 微衛(wèi)星和ISSR標(biāo)記

ISSR是在微衛(wèi)星標(biāo)記的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的分子標(biāo)記技術(shù)。以微衛(wèi)星標(biāo)記的原理為基礎(chǔ)，隨著獲得微衛(wèi)星重復(fù)單元類型的增加，用微衛(wèi)星序列直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，無需預(yù)先知道基因組序列。

1.1 微衛(wèi)星

微衛(wèi)星是指以少數(shù)幾個(gè)核苷酸（1～5個(gè)）為單位多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，也稱為簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Simple sequence repeats，SSR）或短串連重復(fù)（Short tandem repeats，STR）[11]，它在真核基因組中廣泛分布。微衛(wèi)星主要以2個(gè)核苷酸為重復(fù)單元，也有一些為3個(gè)核苷酸，少數(shù)為4個(gè)或更多[1]。在對(duì)（GT）n、（GA）n、（GATA）n、（GACA）n重復(fù)序列進(jìn)行研究的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，（GT）n重復(fù)序列的拷貝數(shù)由酵母的102拷貝到鼠類基因組的105拷貝[13]；而（GATA）n的拷貝數(shù)在鼠類基因組中約為104拷貝[14]。一般認(rèn)為，微衛(wèi)星的產(chǎn)生是DNA復(fù)制或修復(fù)過程中DNA滑動(dòng)和錯(cuò)配或有絲分裂、減數(shù)分裂期姐妹染色單體不均等交換的結(jié)果[15]。微衛(wèi)星具有許多功能，如重組熱點(diǎn)[16]、對(duì)基因的調(diào)節(jié)和表達(dá)[14]以及性別決定[17]等。同時(shí)微衛(wèi)星具有高多態(tài)性、簡(jiǎn)單的孟德爾遺傳方式，能用PCR擴(kuò)增、提供高質(zhì)量的信息等優(yōu)點(diǎn)[18]，近年來已成為比較理想的分子標(biāo)記方法[6]，廣泛地用于種群遺傳多樣性分析[8]、親子鑒定[19]、遺傳圖譜的構(gòu)建[20]等方面的研究。

檢測(cè)微衛(wèi)星的多態(tài)性，必須獲得所需微衛(wèi)星位點(diǎn)，即根據(jù)已知微衛(wèi)星位點(diǎn)的兩翼序列設(shè)計(jì)引物，這可通過查找已知的微衛(wèi)星引物來實(shí)現(xiàn)：篩選與試驗(yàn)物種親緣關(guān)系較近物種的引物以及用經(jīng)典分子生物學(xué)方法克隆所需的微衛(wèi)星位點(diǎn)[21]。

最近發(fā)展了一些無需知道微衛(wèi)星側(cè)翼序列即可檢測(cè)有關(guān)微衛(wèi)星高多態(tài)性的方法。這是基于對(duì)SSR互補(bǔ)引物的使用。它是利用一系列含有簡(jiǎn)單序列重復(fù)的不同寡核苷酸[5-7]，或者與隨機(jī)引物復(fù)合使用作為引物[21-23]，對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離后，經(jīng)EB染色、銀染或放射自顯影來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性。這種方法與RAPD技術(shù)相似，只用一個(gè)引物，但其所用的引物是在SSR的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的非錨定引物，如引物可能的序列是（GA）10或（CGG）6，擴(kuò)增的是SSR之間的DNA序列，又可稱為MP-PCR（Microsatellite primed-PCR）[23]。

1.2 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)

ISSR方法是以微衛(wèi)星重復(fù)序列作為引物檢測(cè)物種多態(tài)性發(fā)展而來，即在MP-PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而來的[5]。該技術(shù)在SSR序列的5'或3'末端加上2～4個(gè)隨機(jī)選擇的核苷酸作為引物，如：5'端的引物為BDDA（CA）7，3'端的引物為（CA）8RY，以引起特定序列位點(diǎn)的退火，降低其他可能靶標(biāo)退火的數(shù)目。該策略的優(yōu)點(diǎn)是在基因組上只有與錨定的核苷酸匹配的那些位點(diǎn)才能被靶定，因而避免了引物在基因組上的滑動(dòng)，可提高PCR擴(kuò)增反應(yīng)的專一性[24]。這種方法即可對(duì)反向排列、長(zhǎng)度適中的重復(fù)序列間的基因組節(jié)段而非重復(fù)序列本身進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ISSR標(biāo)記通常為顯性標(biāo)記，擴(kuò)增反應(yīng)所用的兩翼引物中，可以是ISSR引物或是隨機(jī)引物[23]；如果一個(gè)是ISSR引物，另一個(gè)是隨機(jī)引物，則又稱為隨機(jī)擴(kuò)增微衛(wèi)星多態(tài)性（Random amplified microsatellite polymorphisms，RAMP）[21]?；?SSR 寡核苷酸直接作為引物來擴(kuò)增基因組DNA的多位點(diǎn)方法，在實(shí)驗(yàn)過程中可由SSR重復(fù)單元序列的改變、引物長(zhǎng)度不同以及5'和3'末端錨定核苷酸的有無產(chǎn)生擴(kuò)增模式的不同[21]。擴(kuò)增產(chǎn)物可以是SSR之間的序列或是SSR之間的序列加上SSR序列，這依賴于不同引物的使用。典型的每個(gè)反應(yīng)每個(gè)泳道產(chǎn)生20多條條帶[5]，依賴于不同的物種和引物。ISSR技術(shù)在同一塊凝膠中可揭示多基因位點(diǎn)的信息，產(chǎn)生用于多樣性分析和基因圖譜的多態(tài)位點(diǎn)標(biāo)記，該技術(shù)提供了一種新的DNA指紋研究方法，可用于分類學(xué)與種系發(fā)生學(xué)的比較以及品種鑒定和種群遺傳學(xué)研究，也可作為遺傳連鎖圖譜構(gòu)建的工具廣泛應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域。

2 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用

ISSR技術(shù)由于引物較長(zhǎng)，退火溫度較高，這就增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性[6,30]，同時(shí)操作簡(jiǎn)單、快速、高效，不需要繁瑣的構(gòu)建文庫、設(shè)計(jì)引物、雜交、同位素顯示等步驟，而且ISSR標(biāo)記可以揭示整個(gè)基因組的一些特征，并成孟德爾式遺傳[5,7]，因此該技術(shù)一問世就在植物遺傳分析中得到廣泛應(yīng)用。ISSR標(biāo)記一般是顯性遺傳[5,7]，在譜帶統(tǒng)計(jì)和遺傳分析中需引起注意。

2.1 遺傳多樣性分析

由于ISSR技術(shù)能提供較大數(shù)目的DNA片段，可以掃描基因組內(nèi)的多態(tài)位點(diǎn)，它在生物學(xué)中最主要的應(yīng)用就是分析和評(píng)估物種、種群、不同品系、甚至是不同種群的遺傳多樣性[24]。余賢美等采用ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)海南、云南、廣西3省的12個(gè)杧果野生居群共265個(gè)個(gè)體的遺傳多樣性水平及居群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究[25]，其中廣西的3個(gè)居群(那坡、邕寧、平南)優(yōu)先與云南的文山居群聚為一支；而云南的永德和版納居群各自聚為一支。Sagar等利用ISSR技術(shù)對(duì)70個(gè)品種的芒果進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ISSR技術(shù)作為檢測(cè)遺傳多樣性是行之有效的方法[26]。何顯靜等對(duì)分布于云南境內(nèi)的紫斑百合（Lilium nepalense）3個(gè)居群進(jìn)行了ISSR分子標(biāo)記分析，平均有17.85%的遺傳變異來自于居群內(nèi)，82.15%的遺傳變異來自于個(gè)體間，表明居群內(nèi)存在巨大的遺傳變異，個(gè)體雜合程度較高，適應(yīng)力強(qiáng)[27]。楊若林等用篩選到的12個(gè)ISSR引物對(duì)我國11個(gè)辣椒農(nóng)家品種進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果共擴(kuò)增出66條譜帶，其中差異條帶26條，多態(tài)條帶比率為39.39%；品種特異條帶7條，占總條帶數(shù)的10.61%[8]?；贘accard遺傳相似性系數(shù)的Neighbor Joining聚類分析可以將11個(gè)辣椒品種分為兩組，每組所含辣椒品種與聚類分析的結(jié)果相同。Talhinhas等應(yīng)用AFLP，ISSR和RAPD分子標(biāo)記技術(shù)分析羽扇豆（Lupinus polyphyllus）種間和種內(nèi)的遺傳多樣性，結(jié)果檢測(cè)到57.00%～78.00%的不相似性，適于研究植物種間遺傳多樣性，表明分子標(biāo)記技術(shù)有助于美國羽扇豆的分類和親緣關(guān)系的鑒定[28]。

2.2 品種和種質(zhì)鑒定

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，為品種和種質(zhì)資源的快速鑒定提供了可能，成功的解決了有效管理、利用物種資源以及對(duì)種質(zhì)的準(zhǔn)確鑒定和評(píng)估問題。Prevost等僅用4個(gè)ISSR引物就可產(chǎn)生大量的多態(tài)性條帶，其中兩個(gè)最富信息量的引物均能將34個(gè)番茄栽培品種區(qū)分開，任意兩個(gè)引物復(fù)合使用均能鑒別所有的栽培品種[29]。Charters等也發(fā)現(xiàn)所測(cè)試的4個(gè)5′端錨定的ISSR引物均能夠區(qū)分20個(gè)蕓苔和芫菁栽培品種中的16個(gè)品種，任意兩個(gè)引物的復(fù)合使用就能區(qū)分所有的20個(gè)栽培品種[30]。也有報(bào)道表明通過ISSR標(biāo)記還可區(qū)分僅能通過水果品質(zhì)加以鑒別柑桔的栽培品種[32]，另外，Wolfe等用居群取樣方法在玄參科吊鐘柳屬Pen stemon雜種復(fù)合體中得到了10～24個(gè)種專一的ISSR標(biāo)記，清楚地支持了物種P.clevelandi的二倍體雜種起源[31]。

2.3 物種和種群親緣關(guān)系研究

ISSR技術(shù)也用于種群內(nèi)、種群間和物種間的研究。Tsumura等采用ISSR方法研究了日本雪松（Cryptomeria japonica）和花旗松（Pseudotsuga menziesii）之間的親緣關(guān)系[32]。結(jié)果表明，24個(gè)ISSR引物有87%～100%左右在這些物種中為多態(tài)性引物，但物種間的多樣性無差異；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，海岸邊的花旗松變種比內(nèi)陸變種的雜合性高。Fang等用10個(gè)SSR引物分析了柑橘35個(gè)種之間的親緣關(guān)系，可將這35個(gè)種分為5個(gè)類群，由ISSR標(biāo)記所得到的分類結(jié)果和前人一致[33]。Gulsen等研究表明枸椽對(duì)檸檬基因組形成有相當(dāng)大的貢獻(xiàn)[34]。Isshiki等對(duì)20個(gè)茄子品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，從100對(duì)引物中篩選出34個(gè)引物用于茄子的ISSR-PCR，擴(kuò)增出552個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，利用這34個(gè)引物可以充分的確定茄子的親緣關(guān)系[10]。Eiadthong等對(duì)13個(gè)泰國芒果品種的ISSR分析表明，其中2個(gè)品種與其他品種關(guān)系較遠(yuǎn)，而另外11個(gè)品種可分為3個(gè)類群[35]。Lanham等對(duì)醋栗的ISSR分析表明，醋栗次級(jí)基因庫遺傳變異豐富，可運(yùn)用于早期育種計(jì)劃[36]。樹狀圖更忠實(shí)地反映了大麥栽培品種間的系統(tǒng)關(guān)系。Dávila等用RAMP技術(shù)來研究歐洲大麥亞種間的遺傳關(guān)系，根據(jù)56個(gè)ISSR多態(tài)性片段，計(jì)算亞種間的遺傳距離[37]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冬季栽培品種和大麥樣品（Hordeum vulgare ssp.Spontaneum）間的遺傳距離最?。涣硗?，Huang等用ISSR和4個(gè)葉綠體DNA非編碼區(qū)的限制性位點(diǎn)變異來研究40個(gè)甘薯屬（Ipomoea）樣品的遺傳多樣性和種內(nèi)關(guān)系[38]。對(duì)比ISSR技術(shù)與核基因DNA限制性分析對(duì)甘薯屬樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，ISSR技術(shù)可檢測(cè)到甘薯屬樣本中較多的遺傳變異。

2.4 遺傳圖譜的構(gòu)建

遺傳圖譜（Genetic map）是指以染色體重組交換率為相對(duì)長(zhǎng)度單位，以遺傳標(biāo)記為主體構(gòu)成的染色體線狀連鎖圖譜。通過構(gòu)建遺傳圖譜可為基因定位與克隆及基因組結(jié)構(gòu)和功能的研究打下基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記數(shù)目少，難以形成較完整的連鎖圖。目前已構(gòu)建了番茄、馬鈴薯、辣椒、萵苣、甘藍(lán)、胡蘿卜、芥菜、豌豆、黃瓜、白菜、芹菜等約20種蔬菜作物遺傳圖譜，其中番茄、馬鈴薯、甘藍(lán)等的圖譜已趨于飽和。張仁兵等用西瓜的重組自交系構(gòu)建了遺傳圖譜，此圖譜包括87個(gè)RAPD標(biāo)記，13個(gè)ISSR標(biāo)記和4個(gè)SCAR標(biāo)記，15個(gè)連鎖群[39]。姜帆等以立冬本龍眼DNA為模板研究了龍眼ISSR-PCR反應(yīng)體系的主要成分對(duì)ISSR擴(kuò)增結(jié)果的影響，并探討了構(gòu)建龍眼指紋圖譜的可行性，利用豐富的多態(tài)性DNA譜帶構(gòu)建了12個(gè)基因型龍眼的指紋圖譜[40]。劉威生等在優(yōu)化的反應(yīng)條件下建立了5個(gè)種12份杏材料的ISSR指紋圖譜[41]。

2.5 基因定位

在蔬菜作物中，許多重要的農(nóng)藝性狀均表現(xiàn)為質(zhì)量性狀遺傳，如抗病性、育性等，可利用分子標(biāo)記進(jìn)行質(zhì)量性狀目標(biāo)基因定位。吳旭紅利用ISSR標(biāo)記技術(shù)獲得了一個(gè)與甜菜抗病基因緊密連鎖的ISSR標(biāo)記ISSR0061，在F2群體分離中符合1∶3的分離比例，有關(guān)ISSR標(biāo)記BA0061-1200抗性基因連鎖的緊密程度還有待今后對(duì)F2分離群體進(jìn)行個(gè)體寄主植株的抗病性鑒定和ISSR對(duì)應(yīng)分析研究[42]。吳旭紅用BSA法和ISSR技術(shù)對(duì)155個(gè)隨機(jī)引物進(jìn)行篩選，獲得了一個(gè)與甜菜根腐病基因緊密連鎖的ISSR標(biāo)記OPP0760，可以用作抗根腐病基因的選擇依據(jù)[43]。

2.6 輔助選擇育種

在育種實(shí)踐中借助分子標(biāo)記對(duì)目標(biāo)性狀的基因型進(jìn)行選擇稱為標(biāo)記輔助選擇（Marker-assisted selection，MAS）。目前在黃瓜分子圖譜中發(fā)現(xiàn)有較多緊密連鎖的位點(diǎn)，特別是一些形態(tài)學(xué)基因（F、dm、B、CcU、11）與一些分子標(biāo)記間存在較緊密的連鎖，可實(shí)施標(biāo)記輔助選擇。Serquen等的研究表明，標(biāo)記輔助選擇用于主莖長(zhǎng)和多側(cè)枝形狀的選擇是有效的[44]。Yu等找到了與抗大豆花葉病毒基因（Rsv）緊密連鎖的SSR標(biāo)記，遺傳距離僅為0.15 cM[45]?？梢?，通過分子標(biāo)記輔助選育可以大大提高育種的選擇效率，為開展作物品種資源鑒定和遺傳改良提供了一種快捷手段。

3 ISSR分子標(biāo)記的展望

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)誕生只有短短幾十年，卻得到了廣泛應(yīng)用，為園藝作物研究開辟了新途徑，更為園藝作物種質(zhì)資源和品種的鑒定、分類、遺傳圖譜構(gòu)建及目標(biāo)性狀基因標(biāo)記等提供了理想方法。因其引物容易設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性強(qiáng)、操作過程簡(jiǎn)單、不須使用同位素的特點(diǎn)，可以揭示更高程度的DNA多態(tài)性。因此，ISSR標(biāo)記在園藝作物研究中具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大潛力。但任何一種分子標(biāo)記都不能解決所有問題，在今后的研究工作中，應(yīng)根據(jù)不同的研究需要，選擇合適的分子標(biāo)記，或?qū)⒉煌臉?biāo)記結(jié)合起來進(jìn)行綜合研究，以提高分子標(biāo)記的選擇效率。

[1]Mukai Y,Suyama Y,Tsumura Y,et al.A linkage map for sugi(Cryptomeria japonica)based on RFLP,RAPD,and isozyme loci[J].Theoretical and Applied Genetics.Theoretische und Angewandte Genetik,1995,90(6):835-840.

[2]Bai D,Brandle J,Reeleder R.Genetic diversity in North American ginseng(Panax quinquefolius L.)grown in Ontario detected by RAPD analysis[J].Genome,1997,40(1):111-115.

[3]Schl?tterer C,Amos B,Tautz D.Conservation of polymorphic simple sequence loci in cetacean species[J].Nature,1991,354(6348):63-65.

[4]Vos P,Hogers R,Bleeker M,et al.AFLP:a new technique for DNA fingerprinting[J].Nucleic Acids Res,1995,23(21):4407-4414.

[5]Zietkiewicz E,Rafalski A,Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics,1994,20(2):176-183.

[6]Godwin I D,Aitken E A,Smith L W.Application of inter simple sequence repeat(ISSR)markers to plant genetics[J].Electrophoresis,1997,18(9):1524-1528.

[7]Gupta M,Chyi Y S,Romero-Severson J,et al.Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats[J].Theor Appl Genet,1994,89:998-1006.

[8]楊若林,孔俊,吳鑫,等.ISSR標(biāo)記在辣椒資源遺傳多態(tài)性分析中的初步應(yīng)用[J].上海大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2005,11(4):423-426,435.

[9]趙淑清,武維華.DNA分子標(biāo)記和基因定位[J].生物技術(shù)通報(bào),2000(6):1-4.

[10]Isshiki S,Iwata N,Mizanur M,et al.ISSR variations in eggplant(Melongena L.)and related Solanum species[J].SciHort,2008,117:186-190.

[11]Chin E C L,Senior L,Shu H,et al.Maize simple repetitive DNA sequences:Abundance and allele variation[J].Genome,1996,39:866-873.

[12]何平.真核生物中的微衛(wèi)星及其應(yīng)用[J].遺傳,1998,20(4):44-49.

[13]Stallings R L,Ford A F,Nelson D,et al.Evolution and distribution of (GT)n repetitive sequences in mammalian genomes[J].Genomics,1991,10(3):807-815.

[14]Sch?fer R,B?ltz E,Becker A,et al.The expression of the evolutionarily conserved GATA/GACA repeats in mouse tissues[J].Chromosoma,1986,93(6):496-501.

[15]王麗娟.微衛(wèi)星DNA及其PCR技術(shù)的進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué):分子生物學(xué)分冊(cè),1996,18(4):169-173.

[16]Bullock P,Miller J,Botchan M.Effects of poly[d(pGpT).d(pApC)]and poly[d(pCpG).d(pCpG)]repeats on homologous recombination in somatic cells[J].Mol Cell Biol,1986(6):3948-3953.

[17]Singh L,Purdom I F,Jones K W.Sex chromosome associated satellite DNA:Evolution and conservation[J].Chromosoma,1980,79(2):137-157.

[18]Tautz D.Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers[J].Nucleic Acids Research,1989,17(16):6463-6471.

[19]Morin P A,Moore J J,Chakraborty R,et al.Kin selection,social structure,gene flow,and the evolution of chimpanzees[J].Science,1994,265(5176):1193-1193.

[20]Hellborg L,Walker C W,Knispel R E,et al.Differentiation and levels of genetic variation in northern European lynx(Lynx lynx)populations revealed by microsatellites and mitochondrial DNA analysis[J].Conservation Genetics,2002,3(2):97-111.

[21]Wu K,Jones R,Danneberger L,et al.Detection of microsatellite polymorphisms without cloning[J].Nucleic Acids Research,1994,22(15):3257-3258.

[22]Sánchez D P,Dávila J A,Loarce Y,et al.Simple sequence repeat primers used in polymerase chain reaction amplifications to study genetic diversity in barley[J].Genome,1996,39:112-117.

[23]Weising K,Atkinson R G,Gardner R C.Genomic fingerprinting by microsatellite-primed PCR:A critical evaluation[J].PCR Methods and Applications,1995,4(5):249-255.

[24]黎裕,賈繼增,王天宇.分子標(biāo)記的種類及其發(fā)展[J].生物技術(shù)通報(bào),1999,15(4):19-22.

[25]余賢美,艾呈祥.杧果野生居群遺傳多樣性ISSR分析[J].果樹學(xué)報(bào),2007,24(3):329-333.

[26]Sagar S I.Genetic diversity analysis of mango cultivars using inter simple sequence repeat markers[J].Current Science,93(8):1135.

[27]何顯靜,李標(biāo),虞泓.紫斑百合居群生物學(xué)研究[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2003,25(S1)∶78-83.

[28]Talhinhas P,Neves M J,Leitao J.Inter andintra specific genetic diversity in lupinus evaluated with AFLP,ISSR and RAPD markers[C].Wild and cultivated lupins from the tropics to the poles:Proceedings of the 10th International lupin conference,2002:19-24.

[29]Prevost A,Wilkinson M J.A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars[J].Theoretical and Applied Genetics.Theoretische und Angewandte Genetik,1999,98(1):107-112.

[30]Charters Y,Robertson A,Wilkinson M,et al.PCR analysis of oilseed rape cultivars(Brassica napus L.ssp.oleifera)using 5′-anchored simple sequence repeat(SSR)primers[J].Theoretical and Applied Genetics.Theoretische und Angewandte Genetik,1996,92(3):442-447.

[31]Wolfe A D,Xiang Q Y,Kephart S R.Diploid hybrid speciation in Penstemon(Scrophulariaceae)[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1998,95(9):5112-5113.

[32]Tsumura Y,Ohba K,Strauss S H.Diversity and inheritance of inter simple sequence repeat polymorphisms in douglas-fir(Pseudotsuga menziesii)and sugi(Cryptomeria japonica)[J].Theoretical and Applied Genetics.Theoretische und Angewandte Genetik,1996,92:40-45.

[33]Fang D Q,Roose M L,Krueger R R,et al.Fingerprinting trifoiate orange germplasm accessions with isozymes,RFLPs,and inter simple sequence repeat markers[J].Theoretical and Applied Genetics.Theoretische und Angewandte Genetik,1997,95:211-219.

[34]Gulsen O,Roose M L.Lemons:diversity and relationships with selected citrus genotypes as measured with nuclear genome markers[J].J Amer Soc Hort Sci,2001,126(3):309-317.

[35]Eiadthong W,Yonemori K,Sugiura A,et al.Identification of mango cultivars of Thailand and evaluation of their genetic variation using the amplified fragments by simple sequence repeat(SSR)anchored primers[J].Sci Hort,1999,82:57-66.

[36]Lanham P G,Korycinska A.B,rennan R M.Genetic diversity with in a secondary gene pool for Ribesnigrum L.revealed by RAPD and ISSR markers[J].J Hort Sci Biotch,2000,75(4):371-375.

[37]Dávila J A,Sánchez D P,Loarce Y,et al.The use of random amplified microsatellite polymorphic DNA and coefficients of parentage to determine genetic relationships in barley[J].Genome,1998,41:477-486.

[38]Huang J C,Sun M.Genetic diversity and relationships of sweetpotato and its wild relatives in Ipomoea series Batatas(Convolvulaceae)as revealed by inter-simple sequence repeat(ISSR)and restriction analysis of chloroplast DNA[J].Theoretical and Applied Genetics.Theoretische und Angewandte Genetik,2000,100(7):1050-1060.

[39]張仁兵,易克,許勇,等.用重組自交系構(gòu)建西瓜分子遺傳圖譜[J].分子植物育種,2003,1(4):481-489.

[40]姜帆,高慧穎,陳秀萍,等.龍眼ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化及指紋圖譜初探[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2007,22(3):256-260.

[41]劉威生,馮晨靜,楊建民,等.杏ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化和指紋圖譜的構(gòu)建[J].果樹學(xué)報(bào),2005,22(6):626-629.

[42]吳旭紅.甜菜抗叢根病基因（Rz1）ISSR分子標(biāo)記的初步研究[J].中國糖料,2005(2):9-11.

[43]吳旭紅.甜菜抗根腐病基因ISSR分子標(biāo)記的初步研究[J].齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2005,21(2):30-32.

[44]Serquen F C,Bacher J,Staub J E.Mapping and QTL analysis of horticultural traits in a narrow cross in cucumber(Cucumis sativus L.)using random-amplified polymorphic DNA markers[J].Molecular Breeding,1997,3(4):257-268.

[45]Yu Y,Maroof M,Buss G.Divergence and allelomorphic relationship of a soybean virus resistance gene based on tightly linked DNA microsatellite and RFLP markers[J].TAG Theoretical and Applied Genetics,1996,92(1):64-69.