黃志銀，曹必好

（1.天津科潤(rùn)蔬菜研究所，300384；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院）

茄子組織培養(yǎng)高效再生植株體系的優(yōu)化

黃志銀1，曹必好2

（1.天津科潤(rùn)蔬菜研究所，300384；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院）

以三月茄為試驗(yàn)材料，探討了不同濃度6-BA、ZT與IAA對(duì)茄子外植體不定芽分化的影響，比較了下胚軸不同接種方式對(duì)不定芽分化的影響和不同生根培養(yǎng)基對(duì)茄子不定芽的生根效果。結(jié)果表明，MS＋I(xiàn)AA（0.2 mg/L）＋6-BA（2.0 mg/L）＋ZT（1.0 mg/L）能加強(qiáng)外植體不定芽的分化能力，帶柄子葉的不定芽分化率達(dá)到60.2%，下胚軸的不定芽分化率達(dá)到98.1%，類Flamingo-bill外植體的不定芽分化率更是達(dá)到了100%；與橫向平接相比，下胚軸正向扦插能提高不定芽的分化率和不定芽分化系數(shù)，還能提前分化；茄子不定芽在MS固體培養(yǎng)基上生根效果最好，生根率達(dá)到100%。

茄子；外植體；再生；分化系數(shù)

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源目的基因?qū)肭炎樱⊿olanum melongenaL.），為茄子育種創(chuàng)造新的種質(zhì)資源，是茄子分子育種的重要途徑之一。實(shí)現(xiàn)外源基因的成功轉(zhuǎn)化的前提是建立一個(gè)茄子高效再生體系。有關(guān)茄子離體再生的研究，在國(guó)內(nèi)外有過(guò)一些報(bào)道，研究者從茄子的器官分化[1～7]、胚狀體誘導(dǎo)[8，9]、花藥培養(yǎng)[10]、小孢子培養(yǎng)[11，12]、原生質(zhì)體培養(yǎng)[13～15]等方面進(jìn)行了研究，不同研究者得到的結(jié)果不一樣。雖然取得了一些成就，但不定芽分化頻率還是不高，仍然不能滿足茄子遺傳轉(zhuǎn)化的要求。本文以三月茄為試材，探討了影響茄子離體培養(yǎng)的主要因素，以期建立適用于茄子遺傳轉(zhuǎn)化的高效再生體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為三月茄，購(gòu)自重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院重慶科光種苗有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

①無(wú)菌苗的獲得 將三月茄種子經(jīng)單蒸水浸泡1 h左右，并沖洗3～5次。在超凈工作臺(tái)上，用75%的酒精消毒0.5～1 min，接著用無(wú)菌水清洗2～3次，再用含2%有效氯的次氯酸鈉溶液浸泡消毒20 min，無(wú)菌水清洗2次后用適量無(wú)菌水浸泡種子5～8 min，最后用無(wú)菌水清洗2～3次后播種在含有0.7%瓊脂和3.0%蔗糖的1/2 MS固體培養(yǎng)基上。接種后在 （25±1）℃和16 h光照/8 h黑暗的條件下培養(yǎng)，2周左右得到待用的無(wú)菌苗。

②分化培養(yǎng)基配方 在加有0.8%瓊脂和3.0%蔗糖的MS培養(yǎng)基中，添加不同濃度的6-BA、IAA和玉米素（ZT），各種培養(yǎng)基配方見(jiàn)表1。

③外植體的制備及接種 將12～14 d苗齡的三月茄無(wú)菌苗，在超凈工作臺(tái)上切成3種類型的外植體（帶柄子葉、下胚軸、類Flamingo-bill——不含生長(zhǎng)點(diǎn)的子葉帶下胚軸），帶柄子葉去掉部分葉尖造成傷口，下胚軸切成1 cm左右長(zhǎng)的小段，類Flamingo-bill外植體的下胚軸保留1 cm左右長(zhǎng)度，3種類型外植體分別接種在含有不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的分化培養(yǎng)基上。

帶柄子葉平放接種，類Flamingo-bill外植體采用3種扦插方式接種，一部分下胚軸以正向扦插的方式接種在分化培養(yǎng)基上，一部分下胚軸反向扦插接種，一部分下胚軸以平放的方式接種，每種外植體每個(gè)處理接種36個(gè)外植體，3次重復(fù)。接種后置于培養(yǎng)室，在（25±1）℃和16 h光照/8 h黑暗的光周期下培養(yǎng)，光強(qiáng)1 600～2 000 lx；每3 d觀察一次，記錄各類外植體的分化情況；每2周繼代一次，4周后分別統(tǒng)計(jì)不同接種方式的3種外植體的愈傷率、不定芽分化率和不定芽分化系數(shù)。愈傷率（%）=（愈傷數(shù)/接種的外植體總數(shù)）×100%；不定芽分化率（%）=（分化不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)）× 100%；不定芽分化系數(shù)=分化的不定芽總數(shù)/分化的外植體總數(shù)。

表1 不同分化培養(yǎng)基配方

④不定芽生根及移栽 待分化的不定芽伸長(zhǎng)至2～3 cm，長(zhǎng)出2片以上真葉時(shí)，將其轉(zhuǎn)接到4種加有0.8%瓊脂和3.0%蔗糖的不同生根培養(yǎng)基[MS，MS＋I(xiàn)AA（0.1 mg/L），MS＋I(xiàn)AA（0.2 mg/L），MS＋NAA（1 mg/L）]上生根，待小植株根系發(fā)達(dá)后，進(jìn)行馴化移栽。在人工氣候培養(yǎng)箱中將封口膜打開(kāi)，煉苗3 d。然后取出小植株，小心洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到土壤透氣性好的花盆中，并覆蓋塑料薄膜，每天對(duì)葉片噴霧3次，以保持濕度，待新葉長(zhǎng)出后，去掉薄膜。將煉苗移栽到大田，2周后統(tǒng)計(jì)組培苗的移栽成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)三月茄愈傷產(chǎn)生和不定芽分化的影響

從表2可以看出，6-BA對(duì)三月茄的不定芽分化效果較好，3種類型外植體的平均不定芽分化率達(dá)到40%以上，最高達(dá)到88.9%。但是在試驗(yàn)中觀察到，當(dāng)加入較高濃度6-BA后，外植體愈傷組織形成較多，一定程度上抑制了不定芽的分化和伸長(zhǎng)；當(dāng)加有低濃度的IAA后，不定芽的分化率明顯提高，平均達(dá)到了60%以上，最高達(dá)到100%。玉米素（ZT）對(duì)三月茄的不定芽分化效果也較理想，0.5～2 mg/L的ZT可使不定芽分化率平均達(dá)到70%以上，最高的達(dá)到100%。同樣玉米素濃度過(guò)高也會(huì)使外植體大量產(chǎn)生愈傷組織，不利于不定芽的分化。當(dāng)把6-BA、IAA和ZT都加入培養(yǎng)基時(shí)（B17），不定芽的分化率明顯提高，平均可達(dá)86.1%，最高達(dá)到100%。 3種外植體均在培養(yǎng)基B17上的分化效果最好，下胚軸和類Flamingo-bill外植體的不定芽分化率及不定芽分化系數(shù)分別達(dá)到了98.1%、3.2和100%、1.8；對(duì)于帶柄子葉來(lái)說(shuō)，不定芽分化率也達(dá)到了60.2%，但是其不定芽的分化系數(shù)不如在B5和B8上高，只有1.4。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)不同外植體類型不定芽分化的影響

2.2 不同類型外植體不定芽分化的比較

試驗(yàn)中觀察到（表2），平放接種的下胚軸和帶柄子葉分化不定芽的方式為先脫分化產(chǎn)生愈傷組織，再?gòu)挠鷤戏只霾欢ㄑ?；扦插接種的下胚軸和類Flamingo-bill外植體主要從頂端的傷口處直接分化出不定芽，插入培養(yǎng)基的部分則產(chǎn)生愈傷組織，有的愈傷能分化出胚狀體，但難以形成正常的不定芽。帶柄子葉不如另外2種外植體的不定芽分化效果好，分化率顯著偏低。在試驗(yàn)中比較了不同外植體的不定芽分化系數(shù)，下胚軸的不定芽分化系數(shù)比另外兩種外植體的高，大多數(shù)都可以分化出兩個(gè)以上的不定芽；而類Flamingo-bill外植體大多數(shù)都產(chǎn)生1個(gè)不定芽，帶柄子葉基本上也是從葉柄部位分化出1個(gè)不定芽。

2.3 不同接種方式對(duì)茄子下胚軸愈傷發(fā)生及不定芽分化的比較

試驗(yàn)觀察到茄子下胚軸橫向平接不定芽分化效果不如正向扦插接好，不定芽分化系數(shù)也沒(méi)有正向扦插的高。如表3所示，以橫向平接的方式接種下胚軸的不定芽分化率只有43%，不定芽分化系數(shù)平均為1.8，而以正向扦插接種的分別達(dá)到98%和 2.6。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)橫向平接的下胚軸愈傷分化能力強(qiáng)，產(chǎn)生大量白色疏松愈傷，且發(fā)現(xiàn)橫向平接的下胚軸只在其植物學(xué)上端發(fā)生不定芽分化，其周圍的愈傷組織不能分化成芽，而正向扦插的下胚軸則從上端直接分化出不定芽，下端仍能分化愈傷組織，且愈傷組織較緊實(shí)，綠色芽點(diǎn)較多，比橫向平接的下胚軸容易分化出不定芽，分化時(shí)間也要早2 d左右。這表明，正向扦插接種能明顯提高不定芽的分化能力和使其提前分化。但是，在試驗(yàn)中觀察到，如果反向扦插接種，則下胚軸只產(chǎn)生愈傷組織，基本沒(méi)有不定芽的分化。

2.4 不同生根培養(yǎng)基對(duì)不定芽生根的影響

如表4所示，不加任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的MS培養(yǎng)基對(duì)茄子的生根效果最好，生根率達(dá)100%，每個(gè)不定芽產(chǎn)生的主根數(shù)量平均達(dá)到4.6條，而且有許多側(cè)根，煉苗移栽全部成活；加有0.1，0.2 mg/L IAA的配方生根效果也較好，MS+IAA（0.1 mg/L）的配方生根率和移栽成活率都達(dá)到100%；當(dāng)IAA濃度達(dá)到0.2 mg/L時(shí)，主根變得粗大，主根數(shù)量較少，組培苗移栽成活率也降低。試驗(yàn)中觀察到當(dāng)加有IAA或者NAA時(shí)不定芽的生根基部有愈傷產(chǎn)生，尤其是加有1 mg/L的NAA時(shí)不定芽基部產(chǎn)生大量的愈傷組織，不利于根的分化，分化的主根和側(cè)根都很少，不利于組培苗移栽成活。

3 結(jié)論與討論

6-BA和ZT是組織培養(yǎng)中廣泛應(yīng)用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，尤其是6-BA在茄科植物[7，10]中應(yīng)用有良好的效果，當(dāng)6-BA難于誘導(dǎo)分化時(shí)，改用或者添加ZT有較好的效果；IAA則能促進(jìn)細(xì)胞的伸長(zhǎng)和分化。本研究在分化培養(yǎng)基B17上，將茄子下胚軸正向扦插接種，不定芽分化率達(dá)到98.1%，分化系數(shù)達(dá)到3.2，而橫向平接的下胚軸不定芽分化率只有43%，分化系數(shù)為1.8；類Flamingo-bill外植體的不定芽分化率可達(dá)到100%，帶柄子葉的達(dá)到60.2%。而同類研究報(bào)道當(dāng)中，俞瓊等[5]得到的茄子子葉不定芽分化率最高為37.0%，下胚軸的最高為46%；余波瀾等[4]得到的最高茄子子葉和下胚軸不定芽分化率分別為37%和67%；張興國(guó)等[3]報(bào)道的三月茄下胚軸最高不定芽分化率也才達(dá)78.8%，這說(shuō)明本研究得到的三月茄不定芽分化效果較好，主要原因?yàn)榕囵B(yǎng)基配方差異和接種方式，因?yàn)橥悎?bào)道都是將下胚軸平放接種在分化培養(yǎng)基上，先脫分化后再分化不定芽，而本研究則以茄子下胚軸正向扦插的方式接種，不定芽的發(fā)生大多數(shù)是直接從傷口處分化；并且與橫向平接相比，正向扦插接種除不定芽分化率高外，分化時(shí)間還可以提前2 d左右，不定芽的伸長(zhǎng)也很容易。

表3 下胚軸不同接種方式對(duì)不定芽發(fā)生的比較

表4 不同配方生根培養(yǎng)基對(duì)三月茄生根效果的比較

本研究同樣觀察到不定芽呈極性分化的現(xiàn)象，結(jié)果和余波瀾等[4]的研究相似。不同的是，當(dāng)下胚軸正向扦插接種時(shí)也能得到第3種類型[4]的愈傷組織，且能觀察到不定芽從愈傷組織上分化出來(lái)，但是大部分玻璃化，較難長(zhǎng)成正常的不定芽。當(dāng)下胚軸正向扦插接種時(shí)，如果植物學(xué)上端插入培養(yǎng)基，則植物學(xué)上端部分分化堅(jiān)實(shí)的深綠色愈傷組織，難以形成不定芽，而其植物學(xué)下端則在空中產(chǎn)生一個(gè)白色泡狀愈傷，但愈傷不會(huì)瘋長(zhǎng)，也不會(huì)分化芽，有的能觀察到根分化。這表明，茄子下胚軸分化不定芽存在極性分化現(xiàn)象，且正向扦插接種利于極性分化的表現(xiàn)，能明顯提高不定芽的分化能力和提前分化。本研究認(rèn)為極性分化發(fā)生可能與子葉柄和下胚軸的近子葉端的分生活躍細(xì)胞容易脫分化和再分化有關(guān)[4]，還可能與植物激素的極性運(yùn)輸有關(guān)，外植體自身產(chǎn)生的激素及其控制的濃度可能更利于不定芽的分化。我們得到的茄子高效再生體系是否具有通用性，還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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Optimization of Efficient Regeneration System of Eggplant in Vitro

HUANG Zhiyin1,CAO Bihao2
(1.Tianjin Kernel Vegetable Research Institute,300384;2.College of Horticulture,South China Agricultural University)

Taking the explants of Sanyueqie as materials,we studied the effects of different concentrations of 6-BA,ZT and IAA mixture on the differentiation of adventitious buds,compared the effects of different inoculated ways of hypocotyls on adventitious bud differentiation and rooting efficiency of different rooting medium on adventitious buds.The results showed that the medium[MS+IAA(0.2 mg/L)+6-BA(2.0 mg/L)+ZT(1.0 mg/L)]could improve the differentiation ability of adventitious buds,and the adventitious bud differentiation rates of cotyledons with petiole,hypocotyls and hypocotyls with a cotyledon were 60.2%,98.1%and 100%respectively.Compared to the parallel inoculation,the normal vertical inoculation was better,with both the bud differentiation rate and bud differentiation coefficient increased and the differentiation time reduced.The solid MS medium possessed the best rooting effect,with the rooting ratio of 100%.

Eggplant;Explant;Regeneration;Differentiation coefficient

10.3865/j.issn.1001-3547.2012.10.002

廣東省科技攻關(guān)項(xiàng)目（2007A020300009-4）；華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校長(zhǎng)基金；天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長(zhǎng)基金

黃志銀（1982-），男，碩士，助研，從事不結(jié)球白菜（油菜）育種研究，電話：13512469223，E-mail：falcon_888@163.com

曹必好，通信作者，電話：020-85280028，E-mail：caobh01@163.com

2012-03-13