袁 程,劉君寒,任曉慧,李福利

(1．河北農(nóng)業(yè)大學 海洋學院,河北 秦皇島 066003;2．中國科學院 青島生物能源與過程研究所,山東 青島266101)

能源短缺成為21世紀人類面臨的一個重大問題,利用微藻生產(chǎn)生物柴油被認為是解決能源短缺的重要途徑。斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)是一種常見的淡水微藻,可以從不同的水體中分離獲得,尤其在污水中,其油脂含量介于 11%～55%[1],可以用于污水處理[2],因此使用斜生柵藻生產(chǎn)生物柴油具有巨大的優(yōu)勢。

微藻在正常的生理條件下,其細胞內(nèi)油脂的積累是相對有限的。研究發(fā)現(xiàn),通過改變培養(yǎng)微藻的營養(yǎng)元素的組成和比例,可以調(diào)控微藻生長的生理,進而誘導微藻細胞油脂的積累,如在氮、磷缺乏的情況下,糖類物質(zhì)等可轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)[3-4]。氮和磷是微藻生長所必須的大量元素,雖然可以通過調(diào)控氮、磷來誘導微藻油脂的積累,但在增加微藻細胞含油量的同時,卻減少了微藻生物量的積累,總體而言并未提高微藻單位體積水體中油脂的生產(chǎn)能力。錳是植物生長所需要的微量元素,對于植物的生理調(diào)節(jié)有重要作用,是植物細胞許多酶的輔因子,如脂肪酸合成途徑中的一些酶;錳還直接參與光合作用,是葉綠素形成的必需物質(zhì)[10]。同時,錳是工業(yè)廢水中的常見排放物,按照國家規(guī)定,工業(yè)廢水中 Mn2+的最高允許排放量為 5×10-3g/L[5]。微藻培養(yǎng)的過程中,水的需求量是巨大的。故探索利用含錳工業(yè)廢水培養(yǎng)微藻來生產(chǎn)油脂,除了可以生產(chǎn)生物柴油、解決燃料問題的同時,還能達到處理工業(yè)廢水、保護環(huán)境的目的。

實驗室前期篩選到一株油脂含量達到干重 46%的斜生柵藻(Scenedesmus obliquus),本文研究了培養(yǎng)基中不同水平的錳離子濃度對該柵藻細胞的生長、總脂含量和脂肪酸組成的影響,為將來大規(guī)模利用含錳工業(yè)廢水培養(yǎng)斜生柵藻生產(chǎn)生物柴油提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種和培養(yǎng)方法

斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)DHD-3為中國科學院青島生物能源與過程研究所微生物資源藻種庫保藏。

將對數(shù)生長期的藻種按照 1 ：10(V/V)的比例接種于含有不同錳離子濃度的BG11培養(yǎng)液中。初始接種OD750為0.2,培養(yǎng)于柱式培養(yǎng)器(Φ4.2cm×38cm),連續(xù)光照(80 μmol /m2·s)、通氣培養(yǎng),CO2濃度為2%,培養(yǎng)溫度為25℃±1℃。

BG11 培養(yǎng)基：NaNO31 500 mg/L;K2HPO440 mg/L;MgSO4·7H2O 75 mg/L;CaCl2·2H2O 36 mg/L;檸檬酸 6 mg/L;檸檬酸鐵銨 6 mg/L;Na2EDTA 1 mg/L;NaCO320 mg/L;H3BO32.86 mg/L;MnCl2·4H2O 1.81 mg/L;ZnSO4·7H2O 0.222 mg/L;NaMoO4·2H2O 0.39 mg/L;CuSO4·5H2O 0.079 mg/L;Co(NO3)2·6H2O 0.049 mg/L;去離子水 1 L,調(diào)節(jié) pH至7.4。

1.2 藻細胞干重的測定、葉綠素含量和蛋白質(zhì)含量的測定

藻細胞干重的測定：收集一定體積的藻液,經(jīng)0.8 μm的微孔濾膜過濾,并于105℃烘至恒重,稱量藻細胞的干重。

葉綠素測定：參照文獻[6]方法進行。

蛋白質(zhì)含量的測定：收集一定體積的藻液,10 000 r/min 離心后,棄上清,加入0.5 mol/L氫氧化鈉溶液,煮沸 10 min,用 BCA 蛋白定量試劑盒(貝博生物,上海)檢測蛋白含量。

1.3 油脂的提取和脂肪酸成分的分析

收集藻細胞,3 500 r/min離心10 min,用去離子水洗滌后,在冷凍干燥機中冷凍干燥 24 h。稱取約30 mg藻粉,按照Bligh-Dyer法,提取總油脂[7]。加入2.5 mL含2%濃硫酸的甲醇,迅速混勻,于85 ℃水浴中反應2 h。冷卻至室溫后,加入2 mL正庚烷和2 mL飽和氯化鈉,充分振蕩并靜置分層,加入一定量 C19脂肪酸甲酯,離心后取上層進行氣相色譜分析。

脂肪酸成分的分析采用氣相色譜法(Varian 450-GC,美國),色譜檢測條件如下：使用CP-WAX58毛細管柱(25 m×0.25 mm),進樣量為 1 μL,分流比為 1 ：30。升溫程序：100 保持 2 min,以10℃/min升至 250℃,保持 3 min。進樣器溫度為：250℃,檢測器溫度為 280℃。以面積歸一法得到各脂肪酸組分的相對含量,脂肪酸標準品為 Sigma公司產(chǎn)品。

2 結(jié)果與分析

2.1 錳離子對斜生柵藻生長的影響

圖1給出了不同初始錳離子濃度的培養(yǎng)基中,經(jīng)14d培養(yǎng)后,斜生柵藻細胞生物量的變化?？傮w而言,在本文實驗研究的錳離子范圍內(nèi),錳離子濃度對微藻生物量的影響不大。僅當初始錳離子添加量為2.72 mg/L時,藻細胞的生物量最大,達到了2.93 g/L;當錳離子濃度較低和較高時,生物量相對略低。馬小妮等[8]研究了錳離子對于微囊藻生長的影響,當錳離子含量在0.055～5.5 mg/L時,對微囊藻的生長會有促進作用,當錳離子含量過高 (55 mg/L)時,反而對微囊藻的生長有抑制作用。本試驗中未發(fā)現(xiàn)錳離子強烈的抑制斜生柵藻的生長的影響,說明在錳離子添加量不超過4.53 mg/L時,不會顯著影響到斜生柵藻的生長。

圖1 經(jīng)過培養(yǎng) 14 d后,不同錳離子添加量對斜生柵藻生物量的影響Fig.1 Effect of different initial concentration Mn ion on biomass of Scenedesmus obliquus after a 14-day culture

2.2 錳離子對斜生柵藻葉綠素積累的影響

葉綠素 a作為植物光合作用的基礎,能夠直接或間接的反映植物生理狀態(tài)的變化。由圖2可知,藻細胞體內(nèi)葉綠素含量在微藻生長前期處在較高水平,并在第4天達到最大,隨著培養(yǎng)時間的延長,體內(nèi)葉綠素a含量逐漸的減少。當藻細胞生長進入穩(wěn)定期,胞內(nèi)油脂開始積累,此時微藻的光合作用減弱,葉綠素a的含量維持在一個較低的水平。

由圖2可知,錳離子對于微藻葉綠素a合成的影響主要在微藻細胞生長的初期。在微藻細胞培養(yǎng)至第2天時,初始液中錳離子濃度較高,影響了微藻細胞內(nèi)葉綠素a的合成,細胞內(nèi)葉綠素a的含量較少。在初始錳離子添加量為2.72 mg/L時,葉綠素a含量最多,但在第4天,其葉綠素水平為不同錳離子添加量里含量最小的,說明在培養(yǎng)的初期,初始液中適當?shù)腻i離子能夠促進葉綠素 a的合成,提高斜生柵藻對環(huán)境的適應能力。

圖2 錳離子對斜生柵藻細胞內(nèi)葉綠素a含量的影響Fig.2 Effect of different initial concentration Mn ion on cellular chlorophyll a content of Scenedesmus obliquus

2.3 錳離子對斜生柵藻細胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的影響

當錳離子初始添加量為0.92 mg/L時,經(jīng)過14d的培養(yǎng)后,微藻細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的含量較少,占細胞干重的5.8%。錳離子初始添加量為1.81 mg/L時,經(jīng)過14d培養(yǎng)后,細胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量較高,占細胞干重的6.6%(圖3)。隨著初始培養(yǎng)液中錳離子添加量的增加,細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的含量逐漸減少。說明高濃度的錳元素能夠影響柵藻細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的積累。但是低濃度的錳元素又會阻礙柵藻細胞的正常生長,從而影響到柵藻細胞物質(zhì)的積累。結(jié)合初始錳離子對斜生柵藻初期細胞體內(nèi)葉綠素 a含量的影響,本試驗中,以培養(yǎng)液中初始錳離子濃度在1.81～2.72 mg/L為柵藻正常生長的最佳添加量。

圖3 經(jīng)過14 d培養(yǎng)后,錳離子對斜生柵藻細胞體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of different initial concentration Mn ion on cellular protein content of Scenedesmus obliquus after a 14-day culture

2.4 錳離子對斜生柵藻細胞油脂含量和油脂產(chǎn)量的影響

圖4給出了在不同初始錳離子濃度的培養(yǎng)液中,經(jīng)14 d培養(yǎng)后斜生柵藻細胞內(nèi)油脂含量的變化,當錳離子添加量為0.92 mg/L和1.81 mg/L時,微藻細胞總脂含量比錳離子添加量為2.72 mg/L時稍低,當初始錳離子添加量為2.72 mg/L時,藻細胞內(nèi)油脂含量最大,達到了細胞干重的 55.1%,相對于對照組(MnCl2·4H2O,1.81 mg/L)提高 11%;隨著錳離子添加量的增大,細胞內(nèi)油脂含量降低較大,當錳離子添加量為3.62 mg/L和4.53 mg/L時,細胞內(nèi)油脂含量分別為細胞干重的 43.1 %和 44.7%,說明培養(yǎng)液中錳離子過少,會影響到斜生柵藻細胞內(nèi)油脂的積累,但高濃度的錳同樣也會抑制藻細胞中油脂的形成與積累;同時,對單位水體中油脂的生產(chǎn)能力分析發(fā)現(xiàn)(圖4),2.72 mg/L是該試驗培養(yǎng)液中錳離子的最佳添加量,此時水體中油脂的生產(chǎn)能力達到 1.6 g/L,相對于對照組(MnCl2·4H2O,1.81 mg/L)提高 14 %。綜合分析,在柵藻的培養(yǎng)過程中需要添加適量的錳離子誘導藻細胞中油脂的積累;本試驗中,最佳的油脂生產(chǎn)能力的錳離子添加量為2.72 mg/L。

圖4 初始液中不同濃度的錳離子添加量對斜生柵藻細胞內(nèi)油脂含量和單位水體中油脂產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of different initial concentration Mn ion on cellular lipid content and yield of lipid in Scenedesmus obliquus

2.5 錳離子對斜生柵藻脂肪酸組成的影響

經(jīng)過14 d的培養(yǎng)后,不同濃度的錳對斜生柵藻脂肪酸組成的影響見表1。根據(jù)標準樣品中14種脂肪酸成分的保留時間,發(fā)現(xiàn)斜生柵藻 DHD-3的總脂中主要含有其中的 8 種,C14 ：0、C20 ：0 以及碳鏈更長的脂肪酸并未檢測到。雖然培養(yǎng)液中添加高濃度的錳離子會造成了斜生柵藻油脂生產(chǎn)能力的下降,但錳離子對于斜生柵藻細胞內(nèi)脂肪酸的組成沒有明顯的影響(P=0.640,P＞0.05就表示在不同錳離子初始濃度下,各組分差別不顯著),C16 ：0 和 C18 ：1 仍是斜生柵藻脂肪酸中的主要成分,其他脂肪酸在總油脂中的比例并未發(fā)生明顯變化。

表1 不同初始濃度的Mn2+對脂肪酸組成的影響Tab.1 Effect of different initial concentration Mn ion on fatty acid composition of Scenedesmus obliquus

3 討論

運用污水培養(yǎng)微藻生產(chǎn)可再生能源,是當前生物能源領域的研究熱點。作為污水排放中重要指標的錳離子,被報道具有調(diào)節(jié)植物光合作用以及植物細胞脂肪酸積累的作用[9]。本試驗研究了錳離子對一株高油脂含量的斜生柵藻生長、油脂積累以及脂肪酸組成的影響,試驗表明經(jīng)過 14 d培養(yǎng)后,該藻的最佳油脂積累的初始錳離子添加量為2.72 mg/L,其生物量和細胞內(nèi)油脂含量分別達到2.9 g/L和55.1%,細胞內(nèi)油脂含量比對照組提高了 11%;同時,單位水體中油脂的產(chǎn)量達到了 1.6 g/L,比對照組提高了14%,但改變錳離子的初始濃度并沒有對斜生柵藻脂肪酸的組成產(chǎn)生明顯影響,說明可以利用錳離子調(diào)控斜生柵藻細胞的油脂積累,增加單位水體中油脂的產(chǎn)量。

郭金耀等[9]研究了錳對鹽藻生長和物質(zhì)積累的影響,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中的錳質(zhì)量濃度為2.0 mg/L或8.0 mg/L時,單個鹽藻細胞中的蛋白質(zhì)含量與β-胡蘿卜素含量均最高,但培養(yǎng)液中細胞密度、鹽藻蛋白質(zhì)含量、β-胡蘿卜素含量都較低。說明了鹽藻生長需要添加適宜的錳離子,同時獲得不同的代謝產(chǎn)物,也可用錳離子進行調(diào)控。Constantopoulos[11]研究了錳離子對Euglena gracilis生長和油脂組成的影響,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中缺乏錳離子時會影響藻細胞的生長,但是缺錳培養(yǎng)未對最終細胞內(nèi)葉綠素含量產(chǎn)生影響;研究還發(fā)現(xiàn),添加錳離子(9 μm)與缺乏錳離子培養(yǎng)藻細胞時,脂肪酸組成會發(fā)生變化;添加錳離子時,藻細胞中油脂含量由無錳離子時的135 μg增加到157 μg;同時油脂中不飽和脂肪酸的含量增加,細胞內(nèi)的不飽和脂肪酸質(zhì)量分數(shù)由不添加錳離子時的27.9%增加至 52.3%,說明錳離子能夠影響到Euglena gracilis細胞內(nèi)油脂含量和脂肪酸組成。

本試驗通過研究錳離子對斜生柵藻生長、油脂積累及脂肪酸組成的影響,為將來室外大規(guī)模利用含錳工業(yè)污水及中水等培養(yǎng)產(chǎn)能微藻提供了試驗基礎。

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