王 寧 耿琳琳 張樹成 賀 斌 王介東

國家人口計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所(北京，100081)

胚胎著床是人類生殖過程中最關(guān)鍵的步驟之一，成功的著床依賴于胚泡的侵入能力和子宮內(nèi)膜的容受性。人的子宮內(nèi)膜在著床的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在每個月經(jīng)周期，子宮只能在短暫的時(shí)間內(nèi)接受胚胎完成著床，這一時(shí)期被稱為“著床窗”，此時(shí)的子宮內(nèi)膜處于接受狀態(tài)。應(yīng)用陰道超聲檢查來評估子宮內(nèi)膜容受性階段具有一定的意義［1］，根據(jù)排卵日B超檢查子宮內(nèi)膜的回聲狀態(tài)，將子宮內(nèi)膜分為三線的A型和均勻的C型。一些研究報(bào)道A型組妊娠率高于C型［1，2］。目前這些嘗試停留在臨床階段，關(guān)于子宮內(nèi)膜超聲分型的分子基礎(chǔ)的相關(guān)研究很少。孕酮在女性生殖過程中起關(guān)鍵性作用［3，4］，與其受體結(jié)合激活了諸如排卵、子宮內(nèi)膜容受性、著床、蛻膜化反應(yīng)和妊娠維持等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。本研究通過檢測孕酮受體A(PRA)和孕酮受體B(PRB)的mRNA和蛋白表達(dá)的情況，初步探討超聲檢查評價(jià)子宮內(nèi)膜容受性的分子基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2010年1～7月在國家人口計(jì)生委科研所臨床中心就診的20名不孕癥婦女，年齡25～35歲。

1.2 儀器和試劑

主要儀器有GeneAmp RNA PCR system 9700、VIDAS全自動免疫酶標(biāo)分析儀。主要試劑有雌二醇檢測試劑盒(PI-30431，生物梅里埃公司)、孕酮

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中國計(jì)劃生育學(xué)雜志 2012年7月 第20卷 第7期 Chin JFam Plann，Vol.20，No.7，July 2012檢測試劑盒(PI-30409，生物梅里埃公司)、鼠抗人單克隆體抗1A6(NCL-PGR，美國Leica公司)、兔抗人多克隆抗體PRB(MS-192-P1，英國Thermo Scientific公司)。

1.3 方法

1.3.1 超聲檢查和研究分組 被檢婦女自然月經(jīng)周期第10天起每1～3天接受1次陰道B超監(jiān)測雙側(cè)卵巢卵泡，同時(shí)觀察子宮縱切面子宮內(nèi)膜厚度及其回聲情況，按文獻(xiàn)［5］進(jìn)行子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)分類:A型，典型三線型或多層子宮內(nèi)膜，外層和中央為強(qiáng)回聲線，外層與宮腔中線之間為低回聲區(qū)或暗區(qū);C型，均質(zhì)強(qiáng)回聲，無宮腔中線回聲。根據(jù)超聲檢查不同類型內(nèi)膜將研究對象分為A型組和C型組。

1.3.2 血清激素測定 經(jīng)B超檢測確認(rèn)排卵后，在排卵后7d刮取兩組子宮內(nèi)膜2條，同時(shí)取空腹靜脈血3ml。靜脈血分離收集血清后，采用酶聯(lián)熒光法(ELFA)按照雌二醇(E2)及孕酮(P)檢測試劑盒操作說明書，利用VIDAS全自動免疫酶標(biāo)分析儀檢測血清中 E2和 P 的水平［6，7］。

1.3.3 RNA提取和RT-PCR 按照TRIZOL試劑使用說明書提取子宮內(nèi)膜組織總RNA。變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性，cDNA合成反應(yīng):含有0.5μg/μl Oligo(dT)18 總體積為 20μl的反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為65℃ 5min，37℃ 1min，50℃60min，70℃ 15min。所用引物:PRA:F5'-GAGCCCACAATACAGCTTCGAG -3'，R5'-CGAAAACCTCCAAGGACCATG-3';PRB:F5'-GGCAGATGCTGTATTTTGCACC -3'，R5'-CAAACCAATTGCCTTGATGAGC-3'。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件:95℃孵育3min，94℃ 變性 20s，59℃ 退火 20s，72℃ 延伸30s。以GAPDH為內(nèi)參，用Ct值方法表示mRNA表達(dá)的豐度［8］，用 2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。

1.3.4 免疫組織化學(xué)觀察 子宮內(nèi)膜組織常規(guī)切片制備成5μm的切片。用蘇木精-伊紅(HE)染色后，根據(jù)Noyes分期標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)子宮內(nèi)膜的組織學(xué)狀態(tài)［9］。免疫組織化學(xué)所用的PRA一抗為鼠抗人單克隆抗體(滴度為1:200)，PRB一抗為兔抗人多克隆抗體(滴度為1:300)，切片經(jīng)過脫蠟、復(fù)水后用0.1mol/L pH 7.4的PBS沖洗，3%的過氧化氫封閉5～10min。加一抗于4℃孵育過夜，用生物素標(biāo)記的二抗，鏈霉素過氧化物酶和DAB檢測陽性信號。

1.3.5 免疫組織化學(xué)分析 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果采用半定量的 H-score方法進(jìn)行評分［10］:隨機(jī)選擇10個視野，陽性染色強(qiáng)度以0～3表示，0分為不著色;1分為淺著色;2分為中度著色、深黃色;3分為深著色、棕黃色或咖啡色。著色細(xì)胞所占比例0～25%為1分;25% ～50%為2分;50% ～75%為3分;75%～100%為4分。10個視野染色強(qiáng)度和著色細(xì)胞占比例乘積的平均值做為該組織的組織化學(xué)評分。用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

A型組婦女11例，年齡27.73±2.98歲，不孕年限3.27±0.56 年，月經(jīng)周期 29.07 ±2.22d;C 型組婦女9 例，年齡28.44 ±2.93歲，不孕年限3.98 ±0.37 年，月經(jīng)周期 30.22 ±3.15d。兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 血清E2和P水平

A型組和C型組的E2濃度分別為190.39±5.57 pg/ml和264.88±3.01pg/ml;P濃度分別為17.60±1.17ng/ml和 20.52±1.23ng/ml。兩組的E2和P水平均在本中心相應(yīng)時(shí)期的正常值范圍，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 組織形態(tài)特征

A型組子宮內(nèi)膜主要表現(xiàn)為腺腔增大、彎曲、呈鋸齒狀，腺腔內(nèi)有分泌物，腺上皮細(xì)胞柱狀單層排列，位于細(xì)胞基底部，頂漿分泌旺盛;間質(zhì)細(xì)胞大且圓，間質(zhì)水腫明顯(圖1A)。C型組子宮內(nèi)膜中可見核下空泡;間質(zhì)水腫不明顯(圖1D)。

2.4 RT-PCR 檢測

PRB在A型子宮內(nèi)膜中高表達(dá)，在C型子宮內(nèi)膜中表達(dá)量很低，但PRA的表達(dá)在兩組間沒有差異，見表1。

2.5 IHC結(jié)果和H-score評分

PRA和PRB主要表達(dá)在腺體上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核中。PRB的表達(dá)在A和C型的間質(zhì)細(xì)胞中有差異，但是腺體細(xì)胞中沒有差異，見圖1C和1F。PRA在腺體和間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)都沒有明顯的差異，見圖1B和1E。根據(jù)免疫組織化學(xué)染色陽性信號的分布和強(qiáng)度，對PRA和PRB染色評分，分別比較間質(zhì)和腺上皮中的陽性信號，見表1。

圖1 子宮內(nèi)膜HE染色和免疫組織化學(xué)染色(×40)

表1 各型子宮內(nèi)膜不同PR的mRNA表達(dá)和H-score評分比較(分，±s)

表1 各型子宮內(nèi)膜不同PR的mRNA表達(dá)和H-score評分比較(分，±s)

*與C組比較P＜0.05

分組 n mRNA表達(dá) H-Score評分腺體 間質(zhì)9 0.23 ±0.51 3.44 ±3.01 1.11 ±0.40 PRA A 型組 11 2.31 ±0.91 2.62 ±2.31 3.62 ±2.15 C 型組 9 2.46 ±0.82 2.66 ±2.15 2.42 ±2.10 PRB A 型組 11 4.81 ±1.23* 5.27 ±4.62 3.09 ±2.51*C型組

3 討論

在月經(jīng)周期中，子宮內(nèi)膜在E2和P作用下，經(jīng)歷周期性變化，為成熟胚胎的著床做準(zhǔn)備。臨床根據(jù)超聲中子宮內(nèi)膜的回聲情況分為A型和C型。有研究觀察A型的子宮內(nèi)膜妊娠的成功率遠(yuǎn)高于C型［1，2，10，11］。因此陰道超聲監(jiān)測 hCG 日子宮內(nèi)膜類型對評估內(nèi)膜容受性、預(yù)測臨床妊娠結(jié)局具有重要意義［1］。但是超聲監(jiān)測下對子宮內(nèi)膜進(jìn)行分型的分子依據(jù)并不明了。由于hCG日超聲分型的結(jié)果與E2、P的變化尤其是P的變化緊密相關(guān)，故本研究分別觀察了PRA和PRB的表達(dá)和分布情況，探討其與超聲判斷子宮內(nèi)膜分型中的相互關(guān)系。

本研究組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，在C型內(nèi)膜中，腺體和基質(zhì)的發(fā)育均不充分，處于滯后狀態(tài)，少數(shù)的腺體中還有核下空泡，呈分泌早期腺體特征;同時(shí)分泌中期的重要特征如基質(zhì)細(xì)胞水腫在C型子宮內(nèi)膜中也不明顯。而A型子宮內(nèi)膜中上皮細(xì)胞核下移，腺體發(fā)育充分，腺體卷曲且有明顯的間質(zhì)水腫，提示C型的發(fā)育比A型滯后。同時(shí)，激素測定結(jié)果顯示，這種基于B超和組織形態(tài)學(xué)差異的分型與激素水平無關(guān)。提示兩類型的子宮內(nèi)膜對P的反應(yīng)性不同，導(dǎo)致了B超下兩種不同類型的子宮內(nèi)膜表現(xiàn)。

P對子宮內(nèi)膜細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用離不開特異性的PR［3］。PR和P結(jié)合后調(diào)動PR調(diào)控的下游基因啟動，從而引發(fā)相關(guān)的生理變化，使子宮內(nèi)膜經(jīng)歷一系列的增殖和分化而進(jìn)入成熟胚胎著床的接受狀態(tài)。人PR基因位于第8號染色體，成熟的PR分為兩個亞型PRA和PRB。二者的差別在于PRB比PRA表達(dá)多一段長約164個氨基酸［12］。人月經(jīng)周期中子宮內(nèi)膜不同種類的細(xì)胞中PR的表達(dá)呈周期性變化。上皮細(xì)胞中的PRA在增殖期最多，在分泌中期PR在腺體上皮中的表達(dá)急劇下降，在基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)增高。為了達(dá)到接受胚胎著床的容受狀態(tài)，子宮內(nèi)膜細(xì)胞對P的調(diào)節(jié)作出反應(yīng)，逐漸由增殖狀態(tài)向分化狀態(tài)轉(zhuǎn)移，即子宮內(nèi)膜細(xì)胞在P主導(dǎo)下逐步進(jìn)入接受狀態(tài)。

本研究中，所有子宮內(nèi)膜均取材于分泌中期，PRA的表達(dá)集中于間質(zhì)細(xì)胞，在腺上皮細(xì)胞中表達(dá)極低。不同類型子宮內(nèi)膜中PRA的表達(dá)模式一致，經(jīng)過H-score評分比較后沒有差異，提示B超檢查結(jié)果與組織學(xué)表達(dá)模式的一致性。PRA的主要功能是調(diào)控生殖過程中的排卵、受精和著床等重要環(huán)節(jié)，PRB的主要功能是介導(dǎo)子宮內(nèi)膜中各種細(xì)胞對P的反應(yīng)性［13］。A型子宮內(nèi)膜中PRB無論在RNA水平還是蛋白水平表達(dá)均高于C型。這些結(jié)果提示PR兩種亞型中，PRB亞型主導(dǎo)了間質(zhì)細(xì)胞對P的反應(yīng)性，在調(diào)節(jié)PR對P的反應(yīng)性過程中起關(guān)鍵作用。

綜上所述，PRA的表達(dá)在A型和C型子宮內(nèi)膜中沒有差別，PRB的表達(dá)在A型明顯高于C型。免疫組織化學(xué)分析和評分發(fā)現(xiàn)，這種差異主要存在于間質(zhì)細(xì)胞中。子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞對P的反應(yīng)性是子宮內(nèi)膜接受狀態(tài)形成的關(guān)鍵因素。兩種PR亞型中，PRB在子宮內(nèi)膜容受性好的內(nèi)膜類型中高表達(dá)，表明排卵日子宮內(nèi)膜的超聲分型與PRB在分泌中期的表達(dá)緊密相關(guān)。因此，超聲檢查分型可預(yù)測著床的結(jié)局，PRB可能是其分子基礎(chǔ)，在子宮內(nèi)膜容受性評價(jià)中起重要作用。PRB如何介導(dǎo)P的反應(yīng)性，除PRB還有什么因素或調(diào)控機(jī)制使子宮內(nèi)膜在排卵日呈現(xiàn)不同的回聲狀態(tài)，及其影響子宮內(nèi)膜容受性的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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［責(zé)任編輯:王麗娜］