杜 娟，魏立晶

（1.長春市中心醫(yī)院 腎內(nèi)科，吉林 長春 130051；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科）

肥胖是由于能量攝入超過消耗，導(dǎo)致體內(nèi)脂肪積聚過多而造成的疾病。1997年世界衛(wèi)生組織（WHO）明確宣布肥胖為一種疾病。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和文明程度的提高，人們的飲食習(xí)慣和生活方式也在逐漸的改變，肥胖的發(fā)生率越來越高。

1974年Weisinger等首次報(bào)道嚴(yán)重肥胖患者出現(xiàn)大量蛋白尿并命名為肥胖相關(guān)性腎病 （ORG）。以后有個(gè)案報(bào)告、尸檢資料及臨床病理資料均證實(shí)肥胖可引起腎臟損害。在我們以前的臨床觀察中也發(fā)現(xiàn)，肥胖可以導(dǎo)致蛋白尿的增加［1，2］。但其發(fā)病機(jī)制目前仍不十分清楚。

本研究采用高營養(yǎng)飲食誘導(dǎo)大鼠制成肥胖動(dòng)物模型，檢測尿蛋白的排泄，并探討蛋白尿的變化及意義。

1 研究方法

1.1 肥胖動(dòng)物模型的建立［3］

選擇體重60－100 g之間的健康 Wistar大鼠20只。雌雄不拘，分籠飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)3天。隨機(jī)分為：1）正常對(duì)照組（Con組）：8只；2）實(shí)驗(yàn)組（Ob組）：12只。Con組給予普通飼料，Ob組給予高營養(yǎng)飲食。以上動(dòng)物和飼料均由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。Ob組與Con組在同一環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水。每周稱量體重（g），身長（cm），尾長一次（cm）。

1.2 留取標(biāo)本

在實(shí)驗(yàn)14周時(shí)，Ob組與Con組大鼠均置于代謝籠中，自由飲水，收集24小時(shí)全部尿液，稱取尿液體積（ml），取4 ml備檢測尿蛋白，視黃醇結(jié)合蛋白（RBP），尿肌酐。取大鼠左側(cè)腎臟，置于冰袋上，切取腎臟皮質(zhì)迅速放入2.5%戊二醛中固定，待做電鏡標(biāo)本。腎臟其余部分放入4%多聚甲醛中固定，待做光鏡標(biāo)本。

1.3 觀察指標(biāo)的測定

（1）計(jì)算 Lee’s指數(shù)，體重 （g）1／3×103／體長（cm）。

（2）尿蛋白，RBP，尿肌酐由LX20型生化自動(dòng)分析儀（美國BACKMAN－COULTER公司）測定。

（3）血糖，血脂，血尿酸（UA），血肌酐（Cre），血尿素氮（BUN），胰島素由生化自動(dòng)分析儀測定。

（4）腎小球?yàn)V過率（GFR）用內(nèi)生肌酐清除率（Ccr）表示，Ccr（ml／min）＝尿肌酐濃度（umol／L）／血肌酐濃度（umol／L）×24小時(shí)尿量（ml）／（60分×24）。

（5）常規(guī)制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色及 Masson染色，光鏡下觀察腎臟結(jié)構(gòu)。

（6）常規(guī)制備電鏡標(biāo)本，JEM－1200EX型透射電鏡下觀察，拍攝照片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 0周時(shí)Ob組與Con組比較性別、體重、身長、尾長，Lee’s指數(shù)等無差異（P＞0.05），見表1。

2.2 14周時(shí)Ob組體重、身長，Lee’s指數(shù)明顯高于Con組（p＜0.05），見表2。

表1 Ob組與Con組大鼠基線參數(shù)比較

表2 14周時(shí)Ob組與Con組大鼠體重比較

2.3 Ob組與Con組在14周時(shí)比較尿量無明顯差異，RBP無明顯差異，Ob組在14周時(shí)尿蛋白明顯高于Con組（P＜0.05），見表3。

表3 不同時(shí)間Ob組與Con組大鼠尿蛋白比較

2.4 14周時(shí)Ob組Ccr明顯高于Con組（P＜0.01）。

2.5 14周時(shí)Ob組與Con組比較空腹血糖升高，高密度脂蛋白降低（P＜0.05）。Ob組個(gè)別大鼠的胰島素高達(dá)44.42IU／ml，但二組間比較無明顯差異。Ob組個(gè)別大鼠呈乳糜血，但二組間甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白無明顯差異。Ob組與Con組比較血尿酸（UA），血肌酐（Cre），血尿素氮（BUN）等無差異（P＞0.05），見表4。

表4 14周時(shí)Ob組與Con組大鼠血生化指標(biāo)的比較

2.6 14周時(shí)Ob組與Con組光鏡下腎臟病理觀察結(jié)果：Con組大鼠腎臟為正常組織結(jié)構(gòu)，見圖1和圖3。Ob組大鼠腎臟被膜光滑，腎小球在切片上呈圓形，鏡下見腎皮質(zhì)區(qū)腎小球肥大，腎小囊狹窄，節(jié)段性毛細(xì)血管閉塞，球囊粘連，見圖2和圖4。

2.7 14周時(shí)電鏡下腎臟皮質(zhì)觀察結(jié)果：Con組大鼠腎臟為正常腎小球結(jié)構(gòu)，見圖5。Ob組大鼠腎臟腎小球?yàn)V過膜結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)皮細(xì)胞呈固縮狀細(xì)胞核，核內(nèi)染色質(zhì)趨邊凝聚；基底膜輕度增厚，偶見雙軌征；足細(xì)胞呈粗大狀，核呈不規(guī)則形，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，可見次級(jí)溶酶體，還可見均質(zhì)狀圓形小體，足突輕度微絨毛化；系膜區(qū)基質(zhì)增生，系膜細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞核呈不規(guī)則型，核內(nèi)異染色質(zhì)趨邊凝聚；毛細(xì)血管腔內(nèi)可見大量紅細(xì)胞，見圖6。

3 討論

3.1 高熱量飲食誘導(dǎo)大鼠制成肥胖動(dòng)物模型

肥胖是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，鑒于臨床中大多數(shù)肥胖患者是由于高熱量飲食導(dǎo)致的，故本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)Wistar大鼠制成肥胖動(dòng)物模型。

幼年動(dòng)物對(duì)高脂食物更敏感，所以實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，選擇體重60－100 g之間的健康 Wistar大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和肥胖模型組，二組間的性別、體重、身長、尾長，Lee’s指數(shù)等均無差異。正常對(duì)照組給予普通飼料，每克含熱量12.4焦耳，而肥胖模型組給予高脂肪高熱量飼料，每克含熱量16.9焦耳。飼料中高比例的脂肪成分可能破壞了能量攝入的調(diào)節(jié)機(jī)制，引起所謂的“高脂性食欲亢進(jìn)”［4］。14周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，Ob組體重、身長，Lee’s指數(shù)明顯高于Con組（P＜0.05）。Ob組出現(xiàn)血脂異常，其中高密度脂蛋白明顯低于Con組（P＜0.05），甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白與Con組比較雖無明顯升高，但亦有上升的趨勢。Ob組大鼠腹部脂肪較多，腎臟的大體標(biāo)本可見腎周脂肪組織較多，反映了局部脂肪組織的蓄積，因此認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了營養(yǎng)性肥胖大鼠模型。

3.2 肥胖大鼠蛋白尿的排泄增加

本實(shí)驗(yàn)觀察了二組大鼠分別在14周的尿量變化。在不同的時(shí)間點(diǎn)二組大鼠的尿量無明顯變化，但Ob組有減少的趨勢，與既往報(bào)道相同［5］。

此外還觀察了二組大鼠分別在14周的尿蛋白變化。二組間比較RBP的變化亦不明顯，RBP可自由通過腎小球?yàn)V過膜，99.97%在近曲小管被重吸收，故正常情況下尿中含量甚微。當(dāng)腎小管受損傷時(shí)，RBP重吸收減少，尿中排泄增加，而從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，Ob組大鼠的腎小管損害并不嚴(yán)重。

14周時(shí)Ob組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量明顯高于Con組，正常情況下，腎小球毛細(xì)血管濾過膜的電荷屏障與機(jī)械屏障共同阻擋了血漿中大分子蛋白的濾出，小分子蛋白可以通過毛細(xì)血管壁，但濾過量很小，在近曲小管被重吸收，遠(yuǎn)曲小管分泌蛋白可進(jìn)入尿液，但量很少，所以認(rèn)為尿蛋白的出現(xiàn)及升高是腎小球病理性改變的標(biāo)志。

3.3 肥胖大鼠腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變

本實(shí)驗(yàn)采用HE染色和MASSON染色等方法觀察了Ob大鼠腎臟病理結(jié)構(gòu)，光鏡下可見Ob組大鼠腎小球呈圓形，未見明顯增生和萎縮，毛細(xì)血管袢未見壞死，腎小球毛細(xì)血管未見擴(kuò)張充血，管壁未見增厚，腎小管上皮完好，間質(zhì)無炎細(xì)胞浸潤，為基本正常腎臟結(jié)構(gòu)。與Con組比較無明顯區(qū)別。

本研究通過透射電子顯微鏡觀察Ob大鼠腎小球的結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明Ob組大鼠內(nèi)皮細(xì)胞呈固縮狀細(xì)胞核，核內(nèi)染色質(zhì)趨邊凝聚，有類似凋亡的改變；基底膜輕度增厚，偶見系膜細(xì)胞插入形成的雙軌征；足細(xì)胞呈粗大狀，核呈不規(guī)則形，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，可見次級(jí)溶酶體，還可見均質(zhì)狀圓形小體，足突輕度微絨毛化。

從電鏡結(jié)果來看，肥胖大鼠腎小球超微病理改變明顯，也為肥胖大鼠產(chǎn)生蛋白尿提供有力的形態(tài)學(xué)依據(jù)。國內(nèi)有學(xué)者用形態(tài)計(jì)量學(xué)的方法研究了腎病大鼠足細(xì)胞的形態(tài)變化規(guī)律，并同時(shí)觀察其與不同時(shí)間點(diǎn)尿蛋白排出量的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞體積和形態(tài)的變化與尿蛋白排出量直接相關(guān)，而且足細(xì)胞的變化早于尿蛋白的變化［6］，該結(jié)論支持本研究結(jié)果。

3.4 肥胖導(dǎo)致蛋白尿的機(jī)制及意義

評(píng)價(jià)腎小球?yàn)V過功能最重要的參數(shù)是腎小球?yàn)V過率，即每分鐘經(jīng)腎小球?yàn)V出的血漿液體量。因其檢測方法較復(fù)雜，故采用內(nèi)生肌酐清除率代替。肌酐是肌酸的代謝產(chǎn)物，大部分從腎小球?yàn)V過，不被腎小管重吸收，排泌量很少。而血肌酐的生成量和尿肌酐的排出量較恒定，故每分鐘內(nèi)將若干毫升血液內(nèi)的內(nèi)生肌酐全部清除出去，即為內(nèi)生肌酐清除率。本研究結(jié)果顯示，Ob組大鼠Ccr明顯高于Con組，反映出Ob組大鼠GFR明顯升高。這正是腎功能早期改變的證據(jù)。而此時(shí)反映腎小球?yàn)V過功能的其他指標(biāo)包括尿素氮、血肌酐和血尿酸等尚無明顯改變。

目前認(rèn)為蛋白尿的發(fā)生與腎小球?yàn)V過屏障喪失正常的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)，正常腎小球?yàn)V過膜包括三層結(jié)構(gòu)，從內(nèi)到外為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞層，基底膜和足細(xì)胞層。足細(xì)胞層是尿蛋白濾出的最后屏障，被稱為“細(xì)篩”，也是最容易受損的細(xì)胞成分。近年來人們研究證實(shí)了一系列位于足突裂孔隔膜或由足細(xì)胞表達(dá)的蛋白，這些蛋白在蛋白尿發(fā)生中的作用成為人們研究的熱點(diǎn)。

［1］杜 娟，張素華，吳豪杰，等.重慶市主城區(qū)人群肥胖與微量白蛋白尿的相關(guān)性調(diào)查［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，32（7）：705.

［2］杜 娟，馬俐儒，羅 萍，等.肥胖患者腎臟病理改變及臨床特點(diǎn)分析［J］.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2007，11（8）：1109.

［3］李 才，主編.疾病模型及實(shí)驗(yàn)病理學(xué)［M］.吉林大學(xué)出版社，2002：139－140.

［4］Roma RB，Michelle JS，Jillian LS.Voluntary exercise and monounsaturated canola oil reduce fat gain in mice fed diets high in fat［J］.J Nutrition，1997，127：2006.

［5］Betram MA，Estornell E，Barber T，et al.Nitrogen metabolism in obesity induced by monosodium glutamate in rats［J］.Int J Obes，1992，16：555.

［6］鄧江紅，丁 潔，管 娜，等.嘌呤霉素腎病鼠尿蛋白量與足突形態(tài)改變的關(guān)系［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，2003，12（4）：313.