張 潔 左后娟 李 瑞 徐西振

（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院高血壓病研究所，武漢430030）

胰島細胞凋亡導(dǎo)致的胰島功能受損在2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用已經(jīng)受到越來越多人的重視，而保護胰島beta細胞避免凋亡從而治療T2DM也成為1個嶄新的治療靶點［1，2］。雷諾嗪是一種新型抗局部缺血和心絞痛的藥物，它能影響鈉－鈣平衡改善心肌缺血，減少慢性穩(wěn)定型心絞痛的發(fā)作頻率，增加運動耐量［3］。研究表明，雷諾嗪能降低2型糖尿病患者血糖含量，保護beta細胞功能［4］，然而雷諾嗪是否能抑制高糖高脂誘導(dǎo)的胰島beta細胞的凋亡及通過什么途徑抑制凋亡尚不清楚。因此，我們用雷諾嗪作用于胰島beta細胞株NIT-1，觀察它對胰島細胞凋亡的作用并對相關(guān)機制進行探討。

材料和方法

1.材 料

1.1 主要試劑

NIT-1細胞株（來源于轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島beta細胞系），由本實驗室保存。雷諾嗪購自美國CV Therapeutics公司。胎牛血清（FBS）和DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司。Annexin V／PI凋亡檢測試劑盒、MTT、牛血清白蛋白（BSA）、胰島蛋白酶（Trypsin）購自武漢博士德生物工程有限公司。鼠胰島素放射免疫測定試劑盒購自美國Linco公司。飽和脂肪酸－棕櫚酸（PA）購自美國Sigma公司。兔抗人 Caspase-3抗體 （美國 Santa Cruze公司），PVDF膜 （美國Life Science公司），化學(xué)發(fā)光試劑ECL（Pirce公司）。

1.2 儀器

凝膠成像系統(tǒng) Gene Genius Bio Imaging System為Synegene公司產(chǎn)品；微量紫外分光光度計為美國Bio-Rad公司；超凈工作臺（中國蘇州）；CO2培養(yǎng)箱（Forma）。

2.方 法

2.1 細胞培養(yǎng)

將NIT-1胰島beta細胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清、1×105U／L 青 霉 素 和 100mg／L 鏈 霉 素 的DMEM低糖培養(yǎng)基中，細胞在37℃、5%CO2的環(huán)境中生長，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

2.2 實驗分組

高糖高脂組加（PA 0.5mmol／L、glucose 25mmo／L和BSA 1.32%），治療組（雷諾嗪組）加高糖高脂以及不同濃度的雷諾嗪；正常組加入等量DMEM。

2.3 細胞增殖實驗

用胰酶消化培養(yǎng)瓶中處于對數(shù)生長期的細胞為單細胞懸液，以每孔1.0×104的密度接種于96孔板，每孔培養(yǎng)液體積為100μl，培養(yǎng)24h后吸出培養(yǎng)液，按上述分組給藥，每濃度設(shè)4個復(fù)孔。實驗結(jié)束后每孔加入10%CCK-81μl，在室溫下靜置1h后在自動酶標儀上測定每孔490nm處OD值。CCK-8與MTT類似，顏色深淺與細胞數(shù)目密切相關(guān)，細胞數(shù)目越多，顏色越深，在同體積同種類的細胞中，顏色深淺和細胞數(shù)目呈線性關(guān)系。

2.4 流式細胞儀檢測凋亡

胰酶消化收集按上述分組處理24h的各組細胞，PBS沖洗2次，離心去上清，加500μl buffer重懸，每管加入含F(xiàn)ITC標記的Annexin V 5μl和PI 5μl，室溫避光作用5min后上機檢測。

2.5 Western blot檢測Cleaved caspase-3蛋白表達

將分組處理后的細胞用預(yù)冷的1×PBS洗2次，6孔細胞培養(yǎng)板三去污細胞裂解液（50mmol／L Tris-Hcl pH8.0，150mmol／L NaCl，0.02%NaN3，0.1%SDS，100μg／ml PMSF，1μg／ml Aprotinin，1%NP-40，0.5%去氧膽酸鈉）150μl／孔 裂解細胞，Brandforad法測定細胞蛋白含量。每組取40μg蛋白質(zhì)在12%SDS-PAGE凝膠上電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，1% 脫脂牛奶封閉2.5h，Caspase-3抗體孵育過夜，發(fā)光試劑ECL顯影，曝光，并用凝膠成像分析系統(tǒng)灰度掃描定量蛋白質(zhì)表達量，各組數(shù)據(jù)用beta-actin標準化處理。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)均以ˉx＋SE表示，Western blot的結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)測定蛋白條帶的相對光密度值，每組實驗重復(fù)3次。組間差異比較采用單因素方差分析，F(xiàn)檢驗，采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.細 胞增殖能力分析

結(jié)果顯示雷諾嗪對細胞的保護作用呈濃度依賴性，正常對照組（Normal）OD值為1.48＋0.045，高糖高脂組（Model）OD值為0.75＋0.05、高糖高脂＋0.1μmol／L 雷 諾 嗪 組 （Model＋0.1μmol／L Ranolazine）、高糖高脂＋1μmol／L雷諾嗪組 （Model＋1μmol／L Ranolazine）、高糖高脂＋5μmol／L雷諾嗪組 （Model＋5μmol／L Ranolazine）和高糖高脂＋10μmol／L雷諾嗪組 （Model＋10μmol／L Ranolazine）分別為1.03＋0.052、1.27＋0.041、1.41＋0.032和1.45＋0.06。結(jié)果顯示高糖高脂組與正常組比較NIT-1細胞增殖能力明顯下降（P＜0.05），而與不同濃度雷諾嗪共同作用后，細胞增殖能力隨雷諾嗪濃度增加而逐漸增強，其中以5μmol／L組細胞增殖能力最強，之后增加雷諾嗪濃度不能有效促進細胞增殖。提示雷諾嗪對高糖高脂導(dǎo)致的細胞損傷有隨濃度增加的保護作用（圖1）。

圖1 不同濃度的雷諾嗪對高糖高脂處理后NIT-1細胞增殖能力的影響Fig.1The effect of different concentration Ranolazine on the NIT-1cell proliferate ability.＊P＜0.05vs Normal group；＃P＜0.05vs Model group

2.A nnexin V／PI雙標記檢測細胞凋亡

細胞干預(yù)后通過流式細胞儀計數(shù)FITC＋／PI-的細胞即是早期凋亡的細胞。結(jié)果表明，高糖高脂組中FITC＋／PI-的細胞比例數(shù)目明顯高于正常對照組組（P＜0.05），與雷諾嗪0.1μmol／L共同作用對細胞FITC＋／PI-比例無影響，但隨濃度升高，F(xiàn)ITC＋／PI-的細胞比例逐漸降低，以5μmol／L細胞保護作用最明顯（P＜0.05）（表1）。

3.Cleaved caspase-3蛋白表達

Western blot法，并用beta-actin標準化處理，檢測5μmol／L雷諾嗪作用后 Cleaved caspase-3蛋白表達量的變化。結(jié)果顯示高糖高脂處理后相對于正常對照組Cleaved caspase-3顯影條帶明顯增強（P＜0.05），用5μmol／L雷諾嗪共同作用24h后，條帶強度明顯減弱（P＜0.05）。內(nèi)參beta-actin蛋白在各組的顯影條帶較為一致（圖2）。正常對照組組、高糖高脂組和雷諾嗪組Cleaved-caspase-3的相對表達量比值A(chǔ)1分別為0.41＋0.07、2.48＋0.05和1.14＋0.02（圖3）。

表1 雷諾嗪對高糖高脂處理后NIT-1細胞中FITC＋／PI的細胞比例影響Table 1 The ratio of FITC＋／PI-NIT-1cells among different groups（%.ˉx＋SE＝5）

討 論

胰島素抵抗和胰島細胞功能失調(diào)是2型糖尿病的主要發(fā)病因素，而胰島beta細胞凋亡的增加在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要的作用，已有體外實驗證明，高糖、高脂和炎性細胞因子等因素作用可促進胰島beta細胞的凋亡［5－6］。實驗選用與正常胰島beta細胞無明顯差異的NIT-1細胞進行體外培養(yǎng)，同時用與體內(nèi)高糖高脂環(huán)境類似的高濃度的葡萄糖和飽和脂肪酸－棕櫚酸作用于NIT-1細胞，模擬糖毒性和脂毒性，誘導(dǎo)NIT-1細胞的凋亡。結(jié)果顯示高糖高脂聯(lián)合作用24后，細胞凋亡率顯著增加，提示高糖高脂對beta細胞凋亡有促進作用。如何保護胰島beta細胞，并研究凋亡機制，是目前的重點。已有實驗證明雷諾嗪能顯著降低血液中糖化血紅蛋白HbA1C的含量，并能保護胰島beta細胞，促進胰島素分泌，減低胰島素抵抗，具有良好的臨床應(yīng)用前景［3－4］。但是，雷諾嗪對胰島beta細胞的凋亡影響一直被人們忽視。本實驗通過檢測beta細胞凋亡，表明1.雷諾嗪對高糖高脂造成的beta細胞損傷具有隨濃度增加的保護作用。2.這種保護作用在5μmol／L時最強。實驗中還發(fā)現(xiàn)高糖高脂誘導(dǎo)的NIT-1凋亡伴隨凋亡因子Caspase-3的活化片段Cleaved caspase-3的表達增加，提示Caspase-3的激活參與了NIT-1細胞凋亡損傷機制。Caspase家族在介導(dǎo)細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3正是家族中的關(guān)鍵因子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的多種途徑中發(fā)揮了重要的作用［7－8］。Caspase正常狀態(tài)下以酶原的形式存在于細胞質(zhì)中，在凋亡早期，被多種刺激因素激活，活化后的Caspase-3由2個大亞基和2個小亞基組成，裂解相應(yīng)的細胞質(zhì)胞核底物，最終導(dǎo)致細胞凋亡［9－10］。實驗中5μmol／L雷諾嗪組Caspase-3活化片段的表達較高糖高脂組減少，表明雷諾嗪在抑制細胞凋亡同時減少凋亡因子Caspase-3的激活，提示雷諾嗪對NIT-1細胞保護作用與Caspase-3活化有關(guān)。

由以上實驗可知，Caspase-3在高糖高脂聯(lián)合作用導(dǎo)致的胰島beta細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，進一步的研究證明了雷諾嗪beta細胞的保護作用與Caspase-3的活化有關(guān)，揭示了雷諾嗪保護作用的分子機制，為2型糖尿病的治療和胰島細胞損傷的保護提供了新的方向。

［1］Johnson JD，Luciani DS.Mechanisms of pancreatic beta-cell apoptosis in diabetes and its therapies.Adv Exp Med Biol，2010，654 （2）：447-462

［2］Butler AE，Janson J，Bonner-Weir S，et al.Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2diabetes.Diabetes，2003，52（1）：102-110

［3］Adam D Timmis，Bernard R Chaitman，Michael Crager.Effects of ranolazine on exercise tolerance and HbA1cin patients with chronic angina and diabetes.Eur Heart J，2006，27（1）：42-48

［4］Yun Ning，Wei Zhen，Zhuo Fu，et al.Ranolazine Increases beta Cell Survival and Improves Glucose Homeostasis in Low-Dose Streptozotocin-Induced Diabetes in Mice.JPET，2011，337（5）：50-58

［5］Kharroubi I，Ladrière L，Cardozo AK，et al.Free fatty acids and cytokines induce pancreatic beta-cell apoptosis by different mechanisms：role of nuclear factor-kappaB and endoplasmic reticulum stress.Endocrinology，2004，145（11）：5087-5096

［6］Welters HJ，Tadayyon M，Scarpello JH，et al.Monounsaturated fatty acids protect against beta-cell apoptosis induced by saturated fatty acids，serum withdrawal or cytokine exposure.FEBS Lett，2004，560（3）：103-108

［7］Nicole Liadis，Kiichi Murakami，Mohamed Eweida，et al.Caspase-3-Dependent-Cell Apoptosis in the Initiation of Autoimmune Diabetes Mellitus.Mol Cell Biol，2005，25（9）：3620-3629

［8］Li YH，Wang C，Meng K，et al.Influence of survivin and Caspase-3on cell apoptosis and prognosis in gastric carcinoma.World J Gastroenterol，2004，10（13）：1984-1988

［9］Fennell M，Chan H，Wood A.Multiparameter measurement of caspase 3activation and apoptotic cell death in NT2neuronal precursor cells using high-content analysis.J Biomol Screen，2006，11（3）：296-302

［10］Manabat C，Han BH，Wendland M，et al.Reperfusion differentially induces Caspase-3activation in ischemic core and penumbra after stroke in immature brain.Stroke，2003，34（1）：207-213