欒海蓉，李海林，何志鵬，吳 紅

(牡丹江醫(yī)學院機能學教研室，黑龍江省高校腫瘤疾病防治重點實驗室，黑龍江牡丹江157011)

心臟M3受體具有重要的生理功能和病理意義，在充血性心力衰竭、缺血性心律失常等疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［1］。近期研究表明，激動M3受體對心肌缺血及H2O2誘導的心肌細胞凋亡有保護作用，可以減少離體細胞中烏頭堿和毒毛花苷誘導的細胞內(nèi)鈣超載，對烏頭堿和氯化鋇誘發(fā) Wistar大鼠心律失常的發(fā)生和發(fā)展具有保護作用［2-4］。

激動M3受體可以介導IKM3電流，使鉀離子通道開放，促進鉀離子外流，引起心肌細胞膜的超極化，縮短動作電位時程，導致Ⅱ期平臺期縮短，間接使鈣離子內(nèi)流減少，心肌細胞［Ca2+］i降低。M3受體還可以通過Gq/11激活磷脂酶 C，使膜結(jié)合的二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解為三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)和二酰甘油，兩者作為細胞內(nèi)第二信使，均可以使心肌細胞［Ca2+］i增加。以上兩個通路作用結(jié)果使細胞內(nèi)鈣變化截然相反，因此，該研究采用激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)，分別利用高鉀激活細胞膜電壓依賴性鈣通道，引起外鈣的內(nèi)流，以及咖啡因和IP3激活心肌細胞內(nèi)“鈣池”內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)引起細胞內(nèi)鈣的釋放，觀察M3受體激動劑膽堿對心肌細胞胞質(zhì)游離鈣離子濃度的影響，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年Wistar大鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量250～300 g，由哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 藥品和儀器 4-羥乙基哌嗪乙磺酸［4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES］，乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸［ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid，EGTA］，Na2-ATP，小牛血白蛋白(BSA)，膠原酶Ⅱ，實驗藥物膽堿和4-DAMP(4-diphenylacetoxy-N-methylpiperidine-methiodide)等購自 Sigma公司;Fluo-3/AM，F(xiàn)-127等購自Invitrogen公司，日本Olympus FV-300激光掃描共聚焦顯微鏡。

1.3 溶液配制 包括［5］臺氏液:NaCl 126 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，NaH2PO40.33 mmol/L，MgCl2110 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，用NaOH調(diào)pH至7.35。無鈣臺氏液除沒有CaCl2之外，其余成分與臺氏液相同。細胞保存液(KB液):Glutamic acid 70 mmol/L，Taurin 15 mmol/L，KCl 30 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，KH2PO410 mmol/L，MgCl20.5 mmol/L，EGTA 0.5 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，用 KOH 調(diào) pH 為7.3～7.4。

1.4 大鼠單個心室肌細胞的制備 將大鼠撞擊頭部致昏，仰臥位固定于鼠臺上，迅速開胸取出心臟，置于4℃臺氏液中，游離主動脈并逆行插管連接于Langendorff灌流裝置上，臺氏液8 mL/min流速連續(xù)灌流約5 min，洗去心臟殘血，然后用無鈣臺氏液灌流約10 min至心臟停搏后，用含0.02%膠原酶Ⅱ的無鈣臺氏液灌流分離豚鼠單個心室肌細胞，消化約10 min后自左心室分段剪取心室肌組織，置于盛有KB液的試管中，用吸管輕輕吹打，使之分散成單個細胞，棄除大塊組織，置于 4℃冰箱穩(wěn)定1 h待用［6-7］。

1.5 熒光染料的配制與細胞染色 取穩(wěn)定好的細胞，用20 μmol/L的Fluo-3/AM染色，在37℃恒溫水浴中孵育45 min，去除負載液后，用正常臺氏液再洗滌1次，最后將細胞用正常臺氏液稀釋到所需濃度。取染好色的細胞置于浴槽中，靜置貼壁5 min后用于實驗，光鏡下選取桿狀、橫紋清晰無顆粒的細胞實驗［8］。細胞內(nèi)鈣的增加以熒光強度(fluorescence intensity，F(xiàn)I)升高表示。

1.6 細胞內(nèi)鈣離子(［Ca2+］i)變化的檢測 在Time seriesXYT模式下掃描記錄心肌［Ca2+］i，激發(fā)波長為488 nm，掃描時間程序設定為每10秒采集一次數(shù)據(jù)，連續(xù)采集30次?；A熒光值按最小噪聲最大圖像信號設定，預掃描獲得基礎值后于第2次和第3次掃描間隙之間加入終濃度為30.0 mmol/L KCl，平均熒光強度以給藥后與給藥前的熒光強度比值(FI/FI0)表示。

1.7 統(tǒng)計學方法 圖像分析時，細胞內(nèi)基礎鈣FI定為1.0，加藥后鈣FI的變化為其相對值，以均數(shù)±標準差(±s)表示，統(tǒng)計學處理采用方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 膽堿對靜息狀態(tài)下大鼠心肌細胞內(nèi)鈣熒光強度的作用 在正常臺氏液(含Ca2+1.8 mmol/L)加入膽堿5.0 mmol/L 和 4-DAMP 2.0 nmol/L，對照組加相同體積0.9%的生理鹽水，鈣Fmax/FI0無明顯改變(表1)。

表1 膽堿對靜息狀態(tài)下心肌細胞鈣熒光強度的影響

2.2 膽堿對咖啡因介導Rynaodine受體激動所致大鼠心肌細胞內(nèi)“鈣池”Ca2+釋放的影響 在無鈣臺氏液(含 EGTA 2.0 mmol/L)中，加入終濃度10.0 mmol/L的咖啡因可使細胞內(nèi)熒光強度比值(FI/FI0)增加(2.53±0.24)倍(峰值處)(n=20，與靜息值相比，P＜0.01)。10.0 mmol/L Rynaodine受體的拮抗劑普魯卡因(procaine)孵育心肌細胞15 min，可以抑制咖啡因誘導的心肌細胞內(nèi)鈣FI/FI0的增強。5.0 mmol/L膽堿預先孵育細胞15 min后再用咖啡因激動，內(nèi)鈣升高倍數(shù)無明顯改變(表2)。

10.0mmol/L咖啡因使得心肌細胞內(nèi)FI/FI0增高達到峰值后，加入5.0 mmol/L膽堿不能使FI/FI0降低(圖1)。

表2 膽堿對咖啡因誘導心肌細胞內(nèi)鈣釋放鈣熒光強度的影響

圖1 choline對Caeffni和IP3誘導的細胞內(nèi)鈣釋放的影響

2.3 膽堿對IP3介導IP3受體激動所致大鼠心肌細胞內(nèi)“鈣池”Ca2+釋放的影響 在無鈣臺式液中，加入終濃度10.0 mmol/L IP3使細胞FI/FI0增加(1.81±0.24)倍(n=20，與靜息值相比，P ＜0.01)。測定前預先用IP3受體的拮抗劑肝素(heparin)孵育心肌細胞15 min，肝素可以抑制IP3誘導的心肌細胞內(nèi)鈣FI/FI0的增強。5.0 mmol/L膽堿預先孵育細胞15 min后，不能抑制IP3誘導細胞內(nèi)鈣熒光強度的增強(表3)。

10.0mmol/L IP3使得心肌細胞內(nèi)FI/FI0增高達到峰值后，加入5.0 mmol/L膽堿不能使FI/FI0降低(圖1)。

表3 膽堿對IP3誘導心肌細胞內(nèi)鈣釋放鈣熒光強度的影響

2.4 膽堿對KCI誘導大鼠心肌細胞內(nèi)鈣熒光強度增高(外鈣內(nèi)流)的影響 在正常臺氏液(含1.8 mmol/L Ca2+)中加入30 mmol/L KCl后，［Ca2+］i逐漸升高，F(xiàn)I/FI0增加(2.62 ±0.11)倍(n=20，與靜息值相比，P ＜0.01)。10.0 μmol/L 鈣拮抗劑維拉帕米(verapamil)孵育心肌細胞15 min，可以抑制KCl心肌細胞內(nèi)鈣FI/FI0的增強。當細胞用5.0 mmol/L膽堿預孵15 min后加入KCl，可以明顯降低鈣FI/FI0至(1.42 ±0.13)倍(n=30，與 KCl相比，P ＜0.01)。而細胞用5.0 mmol/L膽堿與2.0 nmol/L 4-DAMP共同預孵 15 min后加入 KCl，F(xiàn)I/FI0恢復至(2.24±0.12)倍(n=30，與膽堿相比，P ＜0.01)(圖 2A)。30.0 mmol/L KCl使得心肌細胞內(nèi)FI/FI0增高達到峰值后，加入5.0 mmol/L膽堿可使FI/FI0明顯降低(圖2B)。

圖2 膽堿對KCI誘導大鼠心肌細胞外鈣內(nèi)流的影響

3 討論

Ca2+在生命活動中起著至關(guān)重要的作用，是影響或決定許多細胞反應和活性的第二信使。細胞內(nèi)Ca2+的調(diào)節(jié)主要包括兩方面:跨膜鈣轉(zhuǎn)運和胞內(nèi)鈣池的調(diào)節(jié)?？缒も}轉(zhuǎn)運包括質(zhì)膜鈣通道、質(zhì)膜鈣泵和Na+/Ca2+交換。胞內(nèi)鈣池的調(diào)節(jié)則包括胞內(nèi)鈣池Ca2+-ATP酶、胞內(nèi)鈣池鈣結(jié)合蛋白、胞內(nèi)鈣池受體鈣通道的調(diào)節(jié)。其中，通過心肌細胞膜電壓依賴性L-鈣離子通道的“外鈣內(nèi)流”和心肌細胞內(nèi)鈣釋放通道IP3R和RyR介導的“內(nèi)鈣釋放”在調(diào)節(jié)心肌細胞內(nèi)游離鈣離子的穩(wěn)定水平發(fā)揮著最重要的作用［9］。

實驗結(jié)果表明，M3受體激動劑膽堿對靜息狀態(tài)下的細胞內(nèi)鈣的濃度無影響，說明膽堿不參與自發(fā)的外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放，不影響靜息狀態(tài)下的心肌細胞對鈣離子的調(diào)節(jié)。

細胞內(nèi)鈣池貯存鈣的釋放主要是由Ryanodine受體系統(tǒng)和IP3受體系統(tǒng)介導，它們均是受體依賴性鈣通道。本實驗采用咖啡因激動心肌細胞Ryanodine受體和IP3激動IP3受體，從而引起心肌細胞［Ca2+］i的增加。結(jié)果表明，不論是前給藥還是后給藥，膽堿均不能拮抗咖啡因和IP3介導胞內(nèi)鈣熒光強度的升高，表明膽堿對心肌細胞內(nèi)鈣池內(nèi)儲鈣的釋放沒有影響。

本實驗中，采用30.0 mmol/L KCl誘導心肌細胞膜上的電壓依賴性鈣通道被激活，L-型鈣通道開放，外鈣內(nèi)流，使得［Ca2+］i明顯升高。分別采用膽堿孵育細胞預先給藥，和先用KCl增高［Ca2+］i然后加入膽堿后給藥兩種方式，結(jié)果表明膽堿均可以拮抗KCl誘導心肌細胞外鈣內(nèi)流的作用，說明膽堿可以阻斷細胞膜L-型鈣通道，從而減少鈣內(nèi)流。4-DAMP是M3受體特異性阻斷劑［10］，2.0 nmol/L 4-DAMP 能恢復 5.0 mmol/L膽堿抑制的KCl除極誘導的心?。跜a2+］i升高，提示該作用可由M3受體調(diào)節(jié)。

實驗結(jié)果表明，雖然M3受體介導的“IKM3”通路和“Gq/11”通路對細胞內(nèi)鈣離子作用相反，但實驗結(jié)果表明，M3受體激動劑膽堿可以通過阻斷細胞膜L-型鈣通道，從而減少鈣內(nèi)流，降低心肌細胞內(nèi)總鈣濃度，抑制鈣超載，從而對缺血性心肌發(fā)揮保護作用。

［1］岳朋，呂延杰，楊寶峰.心臟M3受體作為抗心律失常藥物新靶點研究的［J］.藥學學報，2006，41(8):702-705.

［2］Liu Y，Sun HL，Wu H，et al.Protective effect of M3receptor on H2O2-induced apoptosis of rat myocardial cells in vitro［J］.Acta Pharm Sin，2004，39(11):887-891.

［3］Liu Y，Sun HL，Li DL，et al.Choline produces antiarrhythmic actions in animal models by cardiac M3receptors:improvement of intracellular Ca2+handling as a common mechanism［J］.Can J Physiol Pharmacol，2008，86(12):860-865.

［4］Liu Y，Du J，Gao Y，et al.Role of M3receptor in aconitine/bariumchloride-induced preconditioning against arrhythmias in rats［J］.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2009，379(5):511-515.

［5］楊寶峰，單宏麗，周宇宏.一種篩選抗心律失常藥物新模型的建立［J］.中國藥理學通報，2003，19(2):217-221.

［6］王赫，周宇宏，單宏麗.冬蟲夏草水提液對單個心室肌細胞鉀通道的影響［J］.中國藥理學通報，2004，20(5):536-539.

［7］劉玉梅，周宇宏，單宏麗.延胡索乙素對豚鼠單個心室肌細胞鉀離子通道的影響［J］.中國藥理學通報，2005，21(5):599-601.

［8］初文峰，單宏麗，喬國芬，等.三磷酸肌醇信號途徑參與血小板激活因子誘導豚鼠心室肌細胞鈣濃度增高［J］.中國藥理學與毒理學雜志，2006，2，20(1):48-52.

［9］孫祝美.心肌細胞與鈣離子調(diào)控［J］.廣州醫(yī)藥，2008，39(3):1-3.

［10］Van Zwieten P，Doods H.Muscarinic receptors and drugs in cardiovascular medicine［J］.Cardiovasc Drugs Ther，1995，9(1):159-167.