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DNA條形碼技術(shù)在大型海藻學(xué)研究中的應(yīng)用及前景

2012-02-06 06:17:51丁蘭平馬元元黃冰心
海洋科學(xué) 2012年11期
關(guān)鍵詞:紅藻種間條形碼

丁蘭平, 馬元元, 黃冰心

(汕頭大學(xué), 廣東汕頭 515063)

DNA條形碼(DNA barcoding)是一段特殊的、可用于物種鑒定的DNA序列, 是近幾年以來(lái)國(guó)際上生物分類(lèi)學(xué)研究的主要熱點(diǎn)之一[1], 其技術(shù)的發(fā)展為后現(xiàn)代生物分類(lèi)學(xué)的研究與完善提供了有力的手段。在一定前提條件下, 它既可以用來(lái)驗(yàn)證已知分類(lèi)群鑒定的準(zhǔn)確性, 也可以用來(lái)發(fā)現(xiàn)新的物種。

簡(jiǎn)單地說(shuō), DNA條形碼是通過(guò)對(duì)一組來(lái)自不同生物個(gè)體的較短同源DNA序列進(jìn)行 PCR擴(kuò)增和測(cè)序, 并對(duì)序列進(jìn)行多重比對(duì)和聚類(lèi)分析, 從而將該個(gè)體精確定位到一個(gè)已描述的分類(lèi)群中, 甚至還可提供充分的信息將某些物種定位到特定的地理種群[2]。

迄今為止, 已有大量的基因片段被作為DNA條形碼用于物種的鑒定[3], 既有單一序列也有組合序列[3-5], 但對(duì)于植物 DNA條形碼的選擇還沒(méi)有一個(gè)明確的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。目前, 一般認(rèn)為較理想的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)要具有如下特征: 1)種間具有明顯的變異而種內(nèi)變異足夠小; 2)應(yīng)盡可能是相同的一段DNA片段; 3)DNA片段應(yīng)足夠短, 長(zhǎng)度約700 bp左右, 便于單向測(cè)序; 4)存在高度保守區(qū)域, 便于設(shè)計(jì)通用引物;5)目標(biāo)DNA條形碼應(yīng)包含充分的進(jìn)化信息, 便于對(duì)物種進(jìn)行系統(tǒng)地位確認(rèn)[6-7]。

用 DNA條形碼對(duì)物種進(jìn)行鑒定具有很多優(yōu)點(diǎn),1)不受個(gè)體形態(tài)特征變異和發(fā)育階段影響; 2)對(duì)形態(tài)分類(lèi)難以區(qū)分的類(lèi)群, DNA條形碼可從基因水平上提供一種分類(lèi)鑒定依據(jù); 3)核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)作為數(shù)字化平臺(tái), 能彌補(bǔ)形態(tài)鑒定的不足, 從而有利于加快已知物種的識(shí)別速度。

鑒于近幾年以來(lái)DNA條形碼技術(shù)已在海藻學(xué)研究中得到了一定程度的應(yīng)用和發(fā)展[8-19], 為了跟蹤國(guó)際上的這種新變化, 本文嘗試論述大型海藻學(xué)研究中DNA條形碼技術(shù)的應(yīng)用及前景, 目的是希望將其更廣泛地應(yīng)用于海藻物種多樣性鑒定、新物種的發(fā)現(xiàn)等研究領(lǐng)域, 促使我國(guó)海藻分類(lèi)學(xué)盡快融入國(guó)際后現(xiàn)代分類(lèi)學(xué)系統(tǒng)中。

1 背景及發(fā)展史

人類(lèi)在利用地球自然生物資源過(guò)程中逐步發(fā)展了生物分類(lèi)學(xué), 正確區(qū)分物種, 特別是具有重要經(jīng)濟(jì)和/或環(huán)境價(jià)值的種類(lèi), 都離不開(kāi)對(duì)物種的分類(lèi)鑒定。分類(lèi)學(xué)的主要任務(wù)包括描述和鑒定物種, 提供簡(jiǎn)潔、方便的信息檢索系統(tǒng)。分子系統(tǒng)學(xué)則是借助于分子水平的標(biāo)記, 如基因序列進(jìn)行的系統(tǒng)研究。分子水平標(biāo)記是近十幾年來(lái)廣泛采用的指標(biāo), 但不同的指標(biāo)針對(duì)的系統(tǒng)水平是不同的, 屬間分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)一般采用細(xì)胞核或質(zhì)體基因組標(biāo)記[20]。各種分子遺傳標(biāo)記的研究在陸地生物學(xué)中已深入開(kāi)展, 在海洋生物學(xué)中分子遺傳標(biāo)記的研究也是方興未艾[21]。注意到在物種鑒定中分子系統(tǒng)學(xué)的重要性, 最近數(shù)十年,利用DNA中攜帶的遺傳信息來(lái)探討植物的系統(tǒng)發(fā)育引起了廣泛關(guān)注, 有許多是關(guān)于海藻的[3-4,8,11,22-23]。隨著該領(lǐng)域研究的不斷發(fā)展, 2003年, 加拿大 Paul Hebert教授等首次正式提出了 DNA條形碼的概念[24]。其基本思想是通過(guò)DNA片段中A、T、C和G等 4個(gè)堿基在基因中的排列順序識(shí)別物種, 原理類(lèi)似于現(xiàn)代商品零售業(yè)的條形編碼系統(tǒng)。2004年 5月, 在華盛頓成立了生物條形碼聯(lián)盟(consortium for the barcode of life, CBOL), 致力于發(fā)展鑒定生物物種的全球標(biāo)準(zhǔn)。

2 大型海藻及DNA條形碼技術(shù)的應(yīng)用

2.1 大型海藻

大型海藻一般指紅藻、褐藻、綠藻和藍(lán)藻等四大門(mén)類(lèi), 和海洋浮游藻類(lèi)一起構(gòu)成海洋的主要初級(jí)生產(chǎn)者。我國(guó)大型海藻物種資源比較豐富, 先后報(bào)道了1 277個(gè)物種[25]。長(zhǎng)期以來(lái), 由于簡(jiǎn)單的外部形態(tài)和內(nèi)部生理結(jié)構(gòu)、生理上的趨同性以及高度的表型可塑性, 海洋藻類(lèi)成為用傳統(tǒng)方法難以區(qū)分和鑒定的類(lèi)群。海洋藻類(lèi)的分類(lèi)學(xué)一直是困擾人們的難題[26],隨著 DNA條形碼的出現(xiàn), 近幾年, 該技術(shù)已被逐漸應(yīng)用于各種海洋大型藻類(lèi)的分類(lèi)和鑒定[11-12]。

2.2 DNA條形碼技術(shù)的應(yīng)用

隨著滸苔的暴發(fā), 我國(guó)海藻分類(lèi)學(xué)研究成了頗具爭(zhēng)議的焦點(diǎn)。面對(duì)嚴(yán)峻的質(zhì)疑和挑戰(zhàn), 開(kāi)拓新的分類(lèi)學(xué)方法勢(shì)在必行。其中, DNA條形碼技術(shù)由于具有某些較明顯的優(yōu)勢(shì)而吸引了大家的關(guān)注, 雖然在海洋藻類(lèi)方面尚無(wú)統(tǒng)一的基因片斷和研究標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.1 不同基因序列在大型海藻方面的應(yīng)用

相對(duì)于動(dòng)物DNA條形碼技術(shù)而言, 高等植物和藻類(lèi)DNA條形碼研究進(jìn)展緩慢且存在較大爭(zhēng)議。目前, 已知陸續(xù)有10種基因序列、15對(duì)引物應(yīng)用到總計(jì)3個(gè)門(mén)類(lèi)197個(gè)屬403個(gè)物種中, 而且大多集中在紅藻門(mén), 達(dá)到 58%, 而綠藻門(mén)僅占 5.8%; 研究的基因主要是 COI(Mitochondrialcytochrome c oxidase subunit I, 細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ)基因(26.3%)、ITS(internal transcribed spacer, 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))(17.1%)、UPA(universal plastid amplicon, the portion of 23S rDNA)(12.9%)等[27]。然而一些作者選擇的基因序列及研究對(duì)象各不相同, 無(wú)法判斷目標(biāo)引物的通用性及適用性。

Lin等[28]利用rbcL(1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶大亞基)基因片段擴(kuò)增了仙菜目紅葉藻科 48個(gè)屬91份樣品, 建立了紅葉藻亞科、亮葉藻亞科和紅肋藻亞科等三亞科系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 然而在更高分類(lèi)階元上如科、目等,rbcL基因就起不到應(yīng)有的效果。Saunders等[8]分析了紅藻 3個(gè)群體的 46個(gè)樣品的COI, 發(fā)現(xiàn)它能準(zhǔn)確地區(qū)分形態(tài)相似的種類(lèi), 并發(fā)現(xiàn)了一些新物種。Robba等[9]分析了紅藻門(mén) 6個(gè)目 79份樣品, 發(fā)現(xiàn)其種內(nèi)差異為 0%~2.6%, 屬內(nèi)種間差異為5.2%~27.5%, 因此認(rèn)為COI可以分辨近緣種,且可劃分科級(jí)以下分類(lèi)階元。Sherwood等[29]分析了107份藻類(lèi)樣品, 包括紅藻、綠藻、褐藻、藍(lán)藻等, 發(fā)現(xiàn) UPA片段變異范圍非常大, 可將大多數(shù)種類(lèi)區(qū)分開(kāi)。褐藻分子系統(tǒng)學(xué)研究主要集中在 rRNA基因、rbcL和rbcS序列分析上[26], Lane等[30]利用COI、ITS和rbcSp (Plastid Rubisco operon spacer)基因分析了褐藻門(mén)翅藻屬Alaria的54個(gè)樣品, 發(fā)現(xiàn)單一的COI基因片段效果不佳, 而 3個(gè)基因片段的組合則能有效區(qū)分大部分種類(lèi)。Brodie等[31]分析了紅藻門(mén)紫菜屬 102份樣品, 發(fā)現(xiàn) COI基因片段能將樣品鑒定到種。Yang等[32]分析了紅藻門(mén)江蘺屬11個(gè)種的28份樣品, 發(fā)現(xiàn) COI基因片段在江蘺屬內(nèi)的種間差異為13%±3.2%, 種內(nèi)差異為0.9%, 可將樣品區(qū)分為7個(gè)地理群; 而rbcL基因片段在江蘺屬內(nèi)的種間差異為1.2%~12.6%(平均 9.7%), 種內(nèi)差異為 0.289%。Conklin等[33]分析了紅藻門(mén)麒麟菜屬和卡帕藻屬的15個(gè)樣品, 發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)屬的UPA基因片段有明顯差異, 而屬內(nèi)差異則非常小, 而 COI基因片段在屬級(jí)水平上則有明顯的差異。Freshwater等[14]發(fā)現(xiàn)紅藻門(mén)石花菜目的COI序列比rbcL序列更多變, 在姐妹種間具有更大的間隔區(qū), 認(rèn)為 COI基因更適合作為石花菜目的分子輔助鑒定標(biāo)簽。Rueness[34]對(duì)海洋紅藻中兩種多管藻 COI序列進(jìn)行了比較, 表明它們只有1.2%的不同, 這兩種藻類(lèi)的分類(lèi)情況被解決。KIM等[35]分析了紅藻門(mén)5個(gè)種類(lèi)75個(gè)樣本的COI序列,其中4種江蘺, 一種是龍須菜, 種內(nèi)不符合的偏差范圍在 0%~0.9%之間, 種間偏差是 9.2%~16.1%。Sherwood等[36]分析了紅藻門(mén)的17個(gè)目290份樣品,發(fā)現(xiàn)UPA標(biāo)記序列成功率為64.7%, 而COI序列是46.8%, 表明這兩個(gè)序列在鑒定該樣品方面存在一定的差異性。Mattio等[37]研究潛在的 5種不同的標(biāo)記作為DNA條形碼應(yīng)用在褐藻門(mén)馬尾藻屬, 結(jié)果論證了ITS-2和RubisCO作為條形碼標(biāo)記的不充分性, 雖然它們暗示了作為線(xiàn)粒體標(biāo)記的潛在性, 還需要額外的研究去進(jìn)一步評(píng)估這些標(biāo)記的鑒定成功性。McDevit等[38]分析了褐藻門(mén)20個(gè)屬106個(gè)種的COI基因片段, 發(fā)現(xiàn)其屬內(nèi)種間差異為 3.04%~10.08%,種內(nèi)差異為0.00%~0.46%。Macaya等[13]分析了世界19個(gè)地點(diǎn)的巨藻屬樣品(褐藻門(mén))的 COI基因, 發(fā)現(xiàn)分布于南半球的隔離種類(lèi)均為單倍型的。Kucera[18]將COI-5P(the 5'region of the mitochondrial cytochrome oxidase 1)作為 DNA條形碼應(yīng)用到褐藻門(mén)墨角藻屬Fucus的樣品鑒定中, 發(fā)現(xiàn)它與其他標(biāo)記有相同的作用。

目前在褐藻和紅藻中 COI基因片段都是較為理想的條形碼片段, 但是針對(duì)綠藻 COI基因片段研究較少。

Saunders和Kucera[11]評(píng)估了海洋綠藻的rbcL、tufA、UPA、LSU和ITS等片段作為DNA條形碼標(biāo)記的效果, 發(fā)現(xiàn)僅ITS有較低的成功率、tufA標(biāo)記在擴(kuò)增時(shí)有 95%的成功率(除剛毛藻科外), 認(rèn)為 tufA適合作為海洋綠藻條形碼的標(biāo)準(zhǔn)分子標(biāo)記。騰林宏[39]對(duì)剛毛藻目不同樣品序列的分析和構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)清楚地表明, ITS和18S r DNA序列種間差異明顯大于種內(nèi)差異, 18S rD N A序列種內(nèi)差異0.0%~0.1%, 種間差異在0.3%~6.1%; ITS序列種內(nèi)差異0.0%~1.7%,種間差異 4.9%~63.4%, 顯示出分子方法對(duì)剛毛藻目物種的分類(lèi)鑒定具有重要輔助作用。因此, 她認(rèn)為,根據(jù)國(guó)際DNA條形碼的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn), 這兩個(gè)序列可以作為其分子條形碼對(duì)物種進(jìn)行快速有效的鑒定[39]。

訖今, NCBI(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)已公布了44種藻類(lèi)葉綠體全基因組和40種藻類(lèi)線(xiàn)粒體全基因組序列, 這是進(jìn)一步設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)大型海藻DNA條形碼的有用資源, 將在基因水平闡述各級(jí)分類(lèi)階元的劃分與系統(tǒng)構(gòu)建提供有力的支撐信息。

2.2.2 作為條形碼的不同基因的優(yōu)缺點(diǎn)

DNA條形碼需要有一個(gè)通用的標(biāo)準(zhǔn)序列, 但是找到能夠區(qū)分全部物種的理想DNA片段比較困難。目前認(rèn)為, 線(xiàn)粒體基因適合作為通用DNA條形碼序列, 因?yàn)樗鼪](méi)有內(nèi)含子, 很少有重組現(xiàn)象, 并且大多為母系遺傳的單倍體。但植物線(xiàn)粒體基因組進(jìn)化速率慢, 達(dá)不到條形碼的通用性要求, 因此植物 DNA條形碼序列主要在葉綠體和核基因上進(jìn)行選擇。生物條形碼聯(lián)盟植物工作組已經(jīng)決定將葉綠體rbcL和matK(葉綠體基因組的成熟酶基因)兩個(gè)基因片段作為植物 DNA標(biāo)準(zhǔn)條形碼的核心條碼, 葉綠體trnH-psbA(葉綠體非編碼區(qū)片段)片段和核基因片段ITS為植物DNA條形碼的補(bǔ)充條碼。

(1)COI

2003年, Herbert研究發(fā)現(xiàn)利用COI基因一段長(zhǎng)度為648bp的片斷, 能夠在DNA水平上成功地區(qū)分物種。COI基因序列是區(qū)分種間差異的有效分子標(biāo)記, 因此可以利用 COI基因序列將因地理環(huán)境等因素造成表型各異的不同物種和其他種區(qū)分開(kāi)來(lái)[40]。

COI基因具有以下優(yōu)點(diǎn): 1) COI基因比核基因具有更豐富的系統(tǒng)進(jìn)化信息, 和目前已知的其他蛋白質(zhì)基因相比, COI密碼子第3個(gè)位點(diǎn)的堿基置換更頻繁, 進(jìn)化速率比12S r DNA和16S rDNA快3倍[41];2) COI序列比較短, 在650 bp中就有4650個(gè)ATGC的可能組合, 一般情況下其序列種間遺傳變異大于種內(nèi)遺傳變異[42]。缺點(diǎn): 1)COI基因在植物中的進(jìn)化速率遠(yuǎn)慢于在動(dòng)物中的, 只適用于低等植物中某些藻類(lèi)的鑒定[43-44]; 2)對(duì)通常選擇COI作為DNA條形碼的標(biāo)記基因的, 因 COI不能含蓋全部物種, 所以有時(shí)需要選擇使用其他片段作為輔助標(biāo)記基因。已有研究者研究證實(shí)COI基因作為DNA條形碼能夠準(zhǔn)確地區(qū)分紅藻門(mén)物種[8-9]。

(2)nrITS

核基因組的核糖體DNA ITS片段廣泛分布于光合真核生物(蔗類(lèi)植物除外)中, 是系統(tǒng)學(xué)研究中最常用的片段之一。從Baldwin[45]首次把ITS應(yīng)用于植物系統(tǒng)發(fā)育研究以來(lái), ITS已經(jīng)成為系統(tǒng)發(fā)育重建中最受歡迎的序列之一。

ITS的具有如下優(yōu)點(diǎn): 1)在核基因組中是高度重復(fù)的, 有利于擴(kuò)增、克隆和測(cè)序[46]; (2)經(jīng)過(guò)協(xié)同進(jìn)化,不同 ITS拷貝間的序列接近純合[47], 可對(duì)種間關(guān)系進(jìn)行精確重建。因此Kress等最早將其視為植物條形碼候選片段。組成該片段的不同部分(ITS1、ITS2和5.8S)序列變異差別較大, 5.8S最為保守, ITS1的識(shí)別效果好于ITS2[48]。ITS2片段較短, 易于擴(kuò)增和測(cè)序,尤其對(duì)發(fā)生DNA降解的材料更為有利[49-50], 該片段在種間水平上變異較大, 已被廣泛用于物種分子鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化和植物條形碼研究[6]。

其缺點(diǎn): 1)擴(kuò)增成功率是ITS作為條形碼應(yīng)用的一個(gè)限制因素。Kress和Erickson[51]報(bào)道, ITS1正確識(shí)別率為 81.5%, 但其擴(kuò)增成功率僅為 60.4%, 因此全部樣品的正確識(shí)別率則下降為45.8%。2)長(zhǎng)度變異大, 多數(shù)物種擴(kuò)增片段長(zhǎng)度超過(guò)1 100 bp。3)存在長(zhǎng)的 Poly-G、poly-C和 poly-A, 導(dǎo)致測(cè)序和序列分析困難[52]。4)核基因自身存在多拷貝的特性, 在某些類(lèi)群中種內(nèi)變異較大, 降低了它作為條形碼的應(yīng)用性[51]。已有研究者發(fā)現(xiàn) ITS作為海藻的一些類(lèi)群的DNA條形碼標(biāo)記時(shí)有較低的成功性[11,37]。

但是, 隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及數(shù)據(jù)分析技術(shù)的進(jìn)步, ITS作為組合的條形碼之一, 仍具有很大的應(yīng)用前景。有研究者用包括ITS在內(nèi)的3個(gè)基因研究藻類(lèi), 發(fā)現(xiàn)用 3個(gè)基因片段的組合能夠有效區(qū)分大部分種類(lèi)[30]。

(3)matK

matK序列是植物葉綠體 DNA中進(jìn)化較快的一條編碼區(qū)序列, 也是多位研究者推薦的條形碼序列之一[5]。matK基因位于葉綠體賴(lài)氨酸 tRNA基因(trnK)的內(nèi)含子中, 長(zhǎng)約 1550bp, 編碼一種參與RNA轉(zhuǎn)錄體中II型內(nèi)含子剪切的成熟酶[53], 為單拷貝編碼基因。

matK基因具有如下優(yōu)點(diǎn): 1)其進(jìn)化速率大約是rbcL的2~3倍[54]; 2)該基因在系統(tǒng)學(xué)研究方面的應(yīng)用十分普遍[55-58]。缺點(diǎn): 1)一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)在 DNA條形碼研究中, mazK擴(kuò)增效果并不理想[52,59]; 2)matK片段的引物通用性較差, 鑒定不同類(lèi)群時(shí)往往需要設(shè)計(jì)不同的引物[60-61]。因此, 只有在解決了matK序列的擴(kuò)增問(wèn)題, 才有可能作為 DNA條形碼使用。Sanders等在分析輪藻科6個(gè)屬的藻類(lèi)時(shí), 發(fā)現(xiàn)matK基因能夠鑒定的輪藻科平均分枝長(zhǎng)度超過(guò)rbcL基因的5倍, 更適合輪藻科的分類(lèi)鑒定[62]。目前,matK基因在大型海藻物種鑒定方面的應(yīng)用研究報(bào)道較少。

(4)trnH-psbA

trnH-psbA片段是葉綠體基因中進(jìn)化速率最快的片段之一[63]。其優(yōu)點(diǎn)是1)其序列兩端具有約75bp的保守區(qū), 便于設(shè)計(jì)通用引物[64]; 2)trnH-psbA序列已經(jīng)在很多植物中擴(kuò)增成功, 且有很好的鑒別能力[59];3)92%的物種擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 340~660bp, 且均具有獨(dú)特的間隔區(qū)序列, 符合理想的條形碼標(biāo)準(zhǔn)[6]。其缺點(diǎn)是: 1)該片段中普遍存在插入/缺失事件, 即使在近緣種間也是如此[65], 導(dǎo)致不同物種間片段長(zhǎng)度變異較大; 2)該片段具有較高的突變率和簡(jiǎn)單的序列重復(fù)和重排, 在進(jìn)行序列分析時(shí)需要人工校正[60], 從而限制了在系統(tǒng)發(fā)育研究中的應(yīng)用。由于插入/缺失過(guò)多, 導(dǎo)致trnH-psbA在不同屬物種間的比對(duì)困難[6,66]。然而, 比對(duì)的難易不是條形碼必需的條件,只要建立了適合的條形碼數(shù)據(jù)分析方法, 插入/缺失還將會(huì)豐富物種識(shí)別信息[6]。由于trnH-psbA變異大,主要適用于被子植物中物種豐富的屬。目前, 很少有研究報(bào)道trnH-psbA在大型海藻物種鑒定方面的應(yīng)用。

(5)rbcL

rbcL基因?yàn)楹送?1, 5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)的大亞基, 長(zhǎng)度約為1 400 bP, 無(wú)內(nèi)含子。

rbcL具有如下優(yōu)點(diǎn): 1)在大部分植物中,rbcL片段都比較容易擴(kuò)增和測(cè)序, 已有許多相關(guān)報(bào)道[67-69];2)目前,rbcL基因已廣泛應(yīng)用于被子植物科級(jí)以上較高類(lèi)群之間的系統(tǒng)發(fā)育分析[70]; 3)rbcL序列具有通用、易擴(kuò)增、易比對(duì)的特點(diǎn), 被提議作為條形碼片段,可以用作核心片段將某些未知樣品識(shí)別到種級(jí)以上水平; 4)通過(guò)使用GenBank中大約10 300條長(zhǎng)度大于1 000 bp的rbcL序列進(jìn)行比較分析, Newmaster等發(fā)現(xiàn)盡管rbcL不能識(shí)別全部物種, 但可以區(qū)分不少同屬植物。缺點(diǎn): (1)由于Rubisco在光合作用及光呼吸中所起的關(guān)鍵作用,rbcL基因的進(jìn)化明顯受功能限制, 它的編碼序列高度保守。2)植物中rbcL片段的變異主要存在于種級(jí)以上水平, 物種水平的變異通常不夠[51-52,59,66]。因此, 有人建議將rbcL與其他DNA基因片段組合使用[71]。但存在的問(wèn)題是,rbcL的整體長(zhǎng)度較長(zhǎng)(至少1 300 bp), 需要使用4個(gè)引物并進(jìn)行雙向測(cè)序才能完成整個(gè)基因的測(cè)序[6], 而理想的條形碼要求片段長(zhǎng)度較短, 因此有些研究?jī)H選取其中一段進(jìn)行擴(kuò)增, 如rbcL-a[71]。Kucera 在 2010年對(duì)rbcL、UPA及ITS等片段進(jìn)行了評(píng)估, 發(fā)現(xiàn)rbcL-3P在若干隱存種類(lèi)(由于在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中其形態(tài)停滯, 從而使其根據(jù)形態(tài)特征被命名為同一種名的不同種)中作用很顯著, 能夠很好地區(qū)分石莼屬的種類(lèi)。還有一些研究者已證明了rbcL在鑒定一些大型海藻方面的效果[14,19]。

(6)UPA片段

UPA片段非常適合于藻類(lèi)的研究, 同時(shí)也可作為陸地植物的組合條形碼之一[3]。有研究者提議將UPA片段作為光合作用植物的DNA條形碼, 已有研究表明 UPA片段在海藻中存在一定的變異, 但在陸地植物中變異率很低[52,72-73]。Kucera 在2010年利用COI-5P作為 DNA條形碼對(duì)加拿大紅藻門(mén)紫菜品種進(jìn)行鑒定時(shí), 通過(guò)與rbcL及UPA進(jìn)行了比較, 從而發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新種。姚雪等[27]發(fā)現(xiàn) COI、UPA、rbcL三種基因片段引物具有較高的通用性, 在三個(gè)門(mén)類(lèi)28種海藻的 38份樣品中獲得有效基因序列為65%~82%, 顯示出這三個(gè)基因片段具有一定的通用性?xún)r(jià)值。有研究者分析了紅藻門(mén)多個(gè)類(lèi)群的樣品, 發(fā)現(xiàn)其UPA基因片段能夠較好的辨別物種[33,36]。

(7)多片段組合

如上所述, 在植物中, 采用單片段的識(shí)別率一般不高, 往往不能達(dá)到條形碼的要求[52,59,71-72], 靠一個(gè)片段來(lái)區(qū)分雜交種或存在基因滲透的類(lèi)群也存在問(wèn)題[67]。因此, 很有必要把來(lái)源于不同基因組的片段加以組合。任保青等[74]認(rèn)為: 在整個(gè)植物界, 若想用1個(gè)基因或1個(gè)短的DNA片段來(lái)區(qū)別所有物種幾乎是不可能的, 但是可以通過(guò) 1個(gè)條形碼組合在基因組范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)階層條形碼, 進(jìn)而逐級(jí)縮小鑒定范圍,最終達(dá)到物種自動(dòng)鑒定的目的。多序列組合方案為植物DNA條形碼的研究指出了一個(gè)新的方向, 但根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果篩選出的片段并不能完全滿(mǎn)足DNA條形碼的標(biāo)準(zhǔn), 仍需要大量的實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證它們的物種識(shí)別和鑒定能力。目前, 多序列組合在大型海藻方面也有很廣闊的應(yīng)用前景[31]。

3 DNA條形碼技術(shù)在海藻學(xué)的應(yīng)用前景及存在的問(wèn)題

眾所周知, 大型海藻因其生長(zhǎng)環(huán)境、發(fā)育階段的不同, 外部形態(tài)經(jīng)常發(fā)生很大的變化, 這就給主要依據(jù)形態(tài)特征來(lái)鑒別物種的經(jīng)典分類(lèi)工作帶來(lái)很大困難。某些藻類(lèi)的分類(lèi)結(jié)果一直存在爭(zhēng)議。與此同時(shí)尚存在大量未命名海藻種類(lèi), 已命名的物種也存在同物異名和異物同名現(xiàn)象。新興的DNA條形碼技術(shù)能夠?qū)ξ覈?guó)大型海藻進(jìn)行高效鑒定和分類(lèi), 進(jìn)而加速新物種的發(fā)掘。目前, 利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)我國(guó)大型海藻進(jìn)行物種鑒定和分類(lèi)的報(bào)道還較少。隨著DNA條形碼的廣泛應(yīng)用, 整個(gè)技術(shù)體系日趨完善, 其在我國(guó)大型海藻分類(lèi)鑒定方面將有廣闊的應(yīng)用前景。

需要強(qiáng)調(diào)的是, DNA條形碼技術(shù)的使用不能完全脫離經(jīng)典的分類(lèi)學(xué)研究方法, 尤其是未知或尚未界定的物種的分類(lèi)鑒定工作[75]。

DNA條形碼技術(shù)在應(yīng)用時(shí)仍然存在一些問(wèn)題。在整個(gè)基因組中, 有大量的基因序列能夠滿(mǎn)足我們一個(gè)或多個(gè)要求。作為DNA條形碼技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)基因,必須一方面足夠保守(其引物有強(qiáng)的保守性, 能夠進(jìn)行大范圍的物種擴(kuò) 増 ), 另一方面有足夠的變異來(lái)區(qū)分不同物種從而達(dá)到鑒定的目的, 但是理論上不存在一種普遍適用的DNA條形碼基因。任何一個(gè)基因都不可能在各種生物中都保守, 同時(shí)又包含足夠的序列變異信息來(lái)進(jìn)行物種的辨別。因此, 在鑒定不同的物種時(shí), 需要確定不同的目的基因。另外, 植物的線(xiàn)粒體DNA因雜交和基因滲入而變異很小, 真菌線(xiàn)粒體DNA含有內(nèi)含子。對(duì)這些特殊類(lèi)群的標(biāo)準(zhǔn)條形碼基因的選擇還有待進(jìn)一步探討。另外物種間雜交造成了在種的水平上有較大的差異, 不同物種同一片段的進(jìn)化速率不同, 同時(shí)受制于取樣數(shù)量以及地理群體代表性等, 都可能導(dǎo)致種間遺傳差異的增大。這使得在藻類(lèi)中建立類(lèi)似于動(dòng)物的 COI基因片段DNA條形碼技術(shù)成為一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。但是, 隨著條形碼序列數(shù)據(jù)的不斷積累及其研究范圍的不斷擴(kuò)大, 條形碼技術(shù)將逐漸實(shí)現(xiàn)與世界范圍內(nèi)其他分類(lèi)學(xué)研究計(jì)劃的協(xié)調(diào)發(fā)展, 作為一種物種鑒定工具,勢(shì)必在生物系統(tǒng)學(xué)和分類(lèi)學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。

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