魏東，王國(guó)治

鼠疫F1蛋白原核分泌性表達(dá)及鑒定

魏東，王國(guó)治

目的構(gòu)建重組質(zhì)粒，在大腸桿菌中表達(dá)鼠疫菌 F1 抗原。方法用 PCR 方法擴(kuò)增出帶有信號(hào)肽的 F1 基因，將其克隆到表達(dá)載體 pET30a(+) 上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)；用 IPTG 誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，層析方法純化 F1 蛋白，測(cè)定其分子量、等電點(diǎn)、N 末端氨基酸序列，用 Western blot法檢測(cè)其抗原性。

結(jié)果根據(jù)雙酶切和 DNA 測(cè)序結(jié)果顯示，F(xiàn)1 基因成功連接到表達(dá)載體 pET30a(+) 中，F(xiàn)1 蛋白主要為分泌性可溶表達(dá)。測(cè)定純化后 F1 蛋白的相對(duì)分子量約為 15.6 kD，等電點(diǎn)為 4.15，N 末端氨基酸序列與理論序列一致。經(jīng) Western blot 鑒定，能被兔抗鼠疫菌 EV 株血清識(shí)別。

結(jié)論成功克隆并構(gòu)建了 F1 蛋白分泌性原核表達(dá)系統(tǒng)，所表達(dá)的重組 F1 蛋白具有較好的抗原性，為新型鼠疫疫苗研制提供基礎(chǔ)。

耶爾森菌，鼠疫； 克隆，分子； 基因表達(dá)

鼠疫是由鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis）引起的烈性傳染病。鼠疫菌被列為重要的生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑，一直受到高度重視。人類(lèi)歷史上曾有3 次暴發(fā)流行，奪走數(shù)億人的生命。目前國(guó)內(nèi)外鼠疫疫情有逐漸活躍的趨勢(shì)[1]，2010年秋在我國(guó)西藏暴發(fā)了人間鼠疫，說(shuō)明鼠疫流行有可能死灰復(fù)燃。

傳統(tǒng)鼠疫疫苗有兩種，一種是滅活疫苗，對(duì)腺鼠疫有一定的保護(hù)效果，但因其用強(qiáng)毒株生產(chǎn)，存在著安全性差、保護(hù)期短、接種反應(yīng)率高、不能有效預(yù)防肺鼠疫等問(wèn)題[2-3]；另一種是減毒活疫苗，采用皮上劃痕接種，該方法無(wú)法定量接種，陽(yáng)轉(zhuǎn)率低[4]。因此，迫切需要安全有效的新型鼠疫疫苗。

現(xiàn)有研究證明，鼠疫耶爾森菌免疫保護(hù)性抗原主要是莢膜蛋白抗原分子（fraction F1）和表面抗原（V）分子[5-6]。F1 抗原是一種莢膜蛋白，由 100 kb的 pFra 質(zhì)粒編碼，是鼠疫菌的特異性抗原之一。F1 抗原位于菌體表面，有抗吞噬作用，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，與抗鼠疫感染有密切關(guān)系，是制備新型疫苗不可缺少的成分。本研究構(gòu)建 pET-30a/F1重組表達(dá)質(zhì)粒菌株，并誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，通過(guò)層析純化，獲得了鼠疫 F1 重組蛋白抗原，為新型鼠疫疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 菌種及質(zhì)粒 大腸桿菌 DH5a 和 BL21(DE3)、質(zhì)粒 pET-30a(+) 均由本室保存。

1.1.2 分子生物學(xué)試劑 內(nèi)切酶NdeI、EcoR I、T4 DNA 連接酶、PyrobestDNA 聚合酶、DNA 凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒 DNA 小量純化試劑盒均為日本 TaKaRa 公司產(chǎn)品。

1.1.3 其他鼠疫專(zhuān)用試劑 鼠疫菌 DNA 模板及鼠疫診斷血清（批號(hào) 20020501）均由蘭州生物制品研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的序列（Gene-Bank：X61996）用 Oligo6.0 軟件設(shè)計(jì)引物。F1 上游引物：5′ GGCGAGTCCATATGAAAAAAA TCAGTTCC 3′；F1 下游引物：5′ CCGGAATTCTT ATTGGTTAGATACGGT 3′；下劃線分別為NdeI、EcoR I 酶切位點(diǎn)。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增 F1 抗原結(jié)構(gòu)基因 以鼠疫菌DNA 為模板，以 F1 上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃l min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將上述 PCR 產(chǎn)物通過(guò) 1% 瓊脂糖凝膠電泳，以 DNA 凝膠回收試劑盒回收純化。將 PCR 回收產(chǎn)物與 pET-30a(+)以NdeI 和EcoR I 雙酶切，回收后用 T4 DNA 連接酶連接，以 CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a，在卡那霉素抗性平皿挑選陽(yáng)性克隆。用質(zhì)粒提取試劑盒提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增和雙酶切鑒定，將初步鑒定為陽(yáng)性克隆的菌株測(cè)序。

1.2.4 Fl 蛋白的表達(dá)與純化 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒 pET-30a/F1 陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)，挑選高表達(dá)克隆。將誘導(dǎo)后菌液離心，取上清樣品 ⑴，將菌體沉淀重懸于 PBS，超聲碎菌，取樣品 ⑵，將破碎菌離心，取上清樣品 ⑶，將沉淀重懸于 8 mol/L 尿素溶液，溶解取樣 ⑷，進(jìn)行SDS-PAGE 分析重組蛋白的表達(dá)形式。將構(gòu)建菌株接種于 LB 培養(yǎng)基 37 ℃ 培養(yǎng)，用 IPTG 誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，收獲物經(jīng)離子交換和疏水層析方法純化 F1 蛋白。

1.2.5 F1 蛋白的檢測(cè)與鑒定[7]SDS-PAGE 法測(cè)定其分子量。等電聚焦電泳法測(cè)定 F1 蛋白的等電點(diǎn)。用氨基酸測(cè)序儀測(cè)定 N 末端氨基酸序列。樣品經(jīng) SDS-PAGE 并轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，封閉，用鼠疫診斷血清和辣根過(guò)氧化物酶逐級(jí)標(biāo)記羊抗兔 IgG 抗體，鄰苯二胺（OPD）顯色，進(jìn)行 Western blot 分析。

2 結(jié)果

2.1 F1 基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物及重組質(zhì)粒 pET-30a/F1 的鑒定

圖 1 F1 基因 PCR 擴(kuò)增及 pET-30a/F1 質(zhì)粒雙酶切電泳圖Figure 1 Electrophoretic analysis of F1 PCR product and digested recombinant plasmid pET-30a/F1

PCR 擴(kuò)增目的基因片段經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳，在 500 bp 分子量處見(jiàn)一明顯電泳帶（圖 1A），與理論分子量一致。

以NdeI 和EcoR I 雙酶切重組質(zhì)粒 pET-30a/F1，可見(jiàn)一條 500 bp 的目的基因帶和一條5300 bp 大小的載體片段（圖 1B）。

陽(yáng)性克隆由 Invitrogen 公司進(jìn)行 DNA 測(cè)序，結(jié)果表明，重組質(zhì)粒中 F1 抗原結(jié)構(gòu)基因序列與Gene-Bank（X61996）的基因序列完全相同。

2.2 重組蛋白的表達(dá)及純化

重組蛋白 F1 有 3 種表達(dá)形式：分泌于細(xì)胞外培養(yǎng)基中、細(xì)胞內(nèi)可溶形式以及細(xì)胞內(nèi)包涵體形式（圖 2）。經(jīng)分析，分泌表達(dá)于胞外培養(yǎng)基中的 F1蛋白可溶性好而且純度高，因此我們對(duì)該蛋白進(jìn)行純化。經(jīng)離子交換層析和疏水層析純化，F(xiàn)1 蛋白純度可達(dá) 95%（圖 3）。

圖 2 F1 抗原的表達(dá)形式電泳圖Figure 2 Expression form analysis of F1

圖 3 重組蛋白 F1 的純化電泳圖Figure 3 Analysis of F1 purified products

2.3 Fl 蛋白的檢測(cè)與鑒定

2.3.1 分子量測(cè)定結(jié)果 經(jīng) SDS-PAGE 電泳，根據(jù)薄層掃描的結(jié)果，F(xiàn)1 蛋白在 12% 分離膠的SDS-PAGE 中的表觀分子量在 15.6 kD 左右（圖4）。

圖 4 F1 蛋白 SDS-PAGE 法分子量分析結(jié)果Figure 4 Molecular weight analysis of F1 protein

2.3.2 等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果 等電聚焦電泳法測(cè)定F1 蛋白的等電點(diǎn)為 4.15，與理論等電點(diǎn) 4.3 接近。

2.3.3 N 末端氨基酸的測(cè)定結(jié)果 用氨基酸序列分析儀測(cè)定，其 N 末端 15 個(gè)氨基酸序列為ADLTASTTATATLVE，與理論序列一致。

2.3.4 蛋白質(zhì) Western blot 檢測(cè) 重組蛋白 F1經(jīng) SDS-PAGE 后，將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，進(jìn)行 Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示重組蛋白與抗鼠疫桿菌血清有特異的印跡反應(yīng)(圖 5)。

圖 5 重組蛋白 F1 的免疫印跡分析Figure 5 Western blot of recombinant protein F1

3 討論

F1 結(jié)構(gòu)基因（caf1）受溫度調(diào)節(jié)，37 ℃ 時(shí)能產(chǎn)生 F1 抗原。結(jié)構(gòu)基因長(zhǎng)度為 513 個(gè)單核苷酸，編碼一種分子量為 17.6 kD 的由 170 個(gè)氨基酸組成的多肽，其中包括 21 個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。該信號(hào)肽與大腸桿菌信號(hào)肽有很高的同源性，在分泌到菌體表面時(shí)信號(hào)肽已被切除[8]。本研究通過(guò)對(duì)重組表達(dá)的 F1 蛋白 N 末端氨基酸測(cè)定表明，該信號(hào)肽可被大腸桿菌 BL21(DE3) 識(shí)別并切除，重組蛋白 F1 被分泌到細(xì)胞外。

F1 抗原為一位于鼠疫菌體表面莢膜物質(zhì)，表達(dá) F1 抗原的鼠疫菌對(duì)巨噬細(xì)胞有抗吞噬作用[9]。許多研究表明以 F1 抗原制備的亞單位疫苗可使動(dòng)物產(chǎn)生對(duì)鼠疫的保護(hù)作用，表明 F1 抗原是一種重要的保護(hù)性抗原[10-11]。世界上許多國(guó)家都在進(jìn)行以 F1 抗原為基礎(chǔ)的鼠疫亞單位疫苗研制，有些已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段[12]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因重組技術(shù)在大腸桿菌 BL21(DE3) 中成功地表達(dá)了 F1 抗原。實(shí)驗(yàn)中大腸桿菌表達(dá)的 F1 抗原有 3 種表達(dá)形式，分泌表達(dá)于細(xì)胞外可溶形式，細(xì)胞內(nèi)可溶形式以及細(xì)胞內(nèi)包涵體形式。分泌表達(dá)于細(xì)胞外的 F1 蛋白可溶性好而且純度高，避免了以包涵體形式存在的蛋白在純化過(guò)程中變性劑對(duì)蛋白免疫原性的破壞，有利于 F1 抗原的純化及抗原性保存。對(duì)純化后重組蛋白 F1 的分子量、等電點(diǎn)及 N 末端氨基酸序列進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果與理論一致。免疫印跡結(jié)果也表明該 F1 抗原能與抗鼠疫診斷血清結(jié)合，說(shuō)明重組的 F1 蛋白有良好的抗原性。本研究為新型鼠疫疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

[1]Gao CH.Trends and forecasting of the plague between 80's and 90's of 20th century.Chin J Endemiology, 2000, 19(4):304-306.(in Chinese)

高崇華.20世紀(jì)80-90年代鼠疫動(dòng)態(tài)及預(yù)測(cè)分析.中國(guó)地方病雜志,2000, 19(4):304-306.

[2]Heath DG, Anderson GW Jr, Mauro JM, et al.Protection against experimental bubonic and pneumonic plague by a recombinant capsular F1-V antigen fusion protein vaccine.Vaccine, 1998,16(11-12):1131-1137.

[3]Russell P, Eley SM, Hibbs SE, et al.A comparison of Plague vaccine,USP and EV76 vaccine induced protection against Yersinia pestis in a murine model.Vaccine, 1995, 13(16):1551-1556.

[4]Yan HF.Observations of the serological responses of persons and guinea pigs after vaccination with strain of Yersinia pestis and the guinea pig protection test.Endemic Dis Bull, 1986, 1(3):211-214.(in Chinese)

晏慧芳.鼠疫活疫苗接種后人群和豚鼠血清學(xué)反應(yīng)及豚鼠自動(dòng)保護(hù)力試驗(yàn)觀察.地方病通報(bào), 1986, 1(3):211-214.

[5]Jones SM, Day F, Stagg AJ, et al.Protection conferred by a fully recombinant sub-unit vaccine against Yersinia pestis in male and female mice of four inbred strains.Vaccine, 2000, 19(2-3):358-366.

[6]Huang J, D'Souza AJ, Alarcon JB, et al.Protective immunity in mice achieved with dry powder formulation and alternative delivery of plague F1-V vaccine.Clin Vaccine Immunol, 2009, 16(5):719-725.

[7]Chinese Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China.Volume 3, 2010.Beijing: China Medical Science Press, 2010: appendix 54-55.(in Chinese)

國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.2010年版三部.北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010:附錄54-55.

[8]Galyov EE, Smirnov OYu, Karlishev AV, et al.Nucleotide sequence of Yesinia pestis gene encoding F1 antigen and the primary structure of the protein.FEBS Lett, 1990, 277(1-2):230-232.

[9]Du Y, Rosqvist R, Forsberg A.Role of fraction 1 antigen of Yersinia pestis in inhibition of phagocytosis.Infect Immun, 2002, 70(3):1453-1460.

[10]Andrews GP, Heath DG, Anderson GW Jr, et al.Fraction 1 capsular antigen (F1) purification from Yersinia pestis CO92 and from an Escherichia coli recombinant strain and efficacy against lethal plague challenge.Infect Immun, 1996, 64(6):2180-2187.

[11]Galván EM, Nair MK, Chen H, et al.Biosafety level 2 model of pneumonic plague and protection studies with F1 and Psa.Infect Immun, 2010, 78(8):3443-3453.

[12]Williamson ED, Flick-Smith HC, Lebutt C, et al.Human immune response to a plague vaccine comprising recombinant F1 and V antigens.Infect Immun, 2005, 73(6):3598-3608.

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2012, 7(3):202-205

Secreted expression and identification of F1 protein ofYersinia pestisin prokaryocyte

WEI Dong, WANG Guo-zhi

ObjectiveTo construct the recombinant plasmid expressing F1 protein ofYersinia pestisinE.coliBL21(DE3).

MethodsThe F1 gene was amplified by PCR, cloned into prokaryotic expression plasmid pET30a(+) and then transformed intoE.coliBL21(DE3).The recombinantE.coliBL21(DE3) was induced by IPTG.The protein was purified, and its molecular weight,isoelectric point and N-terminal amino acid sequence was identified.The antigenicity of the protein was measured by Western blot.

ResultsThe F1 protein is mainly expressed in a secreted form by the recombinantE.coliBL21(DE3) strain.Its molecular weight is 15.6 kD identified by SDS-PAGE, and isoelectric point is 4.15.The N-terminal amino acid sequence of the protein is completely the same as expected.As Western blot result shows, the F1 protein could react with plague anti-sera from rabbit.

Conclusion pET-30a/F1 expressing secretive F1 protein is successfully constructed.The F1 protein developed by this study has good immunoreactivity with plague anti-serum.

Yersinia pestis; Cloning, molecular; Gene expression

WANG Guo-zhi, Email: tbtestlab@vip.tom.com

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2012, 7(3):202-205

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.008

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863 計(jì)劃）（2006AA02Z461）

100050 北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院細(xì)菌一室

王國(guó)治，Email：tbtestlab@vip.tom.com

2012-02-13

Author Affiliation: National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China

·綜述·