靳 晶，譚國琴，侯夏沛，劉育鑫，曹 軍

(第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院，陜西西安710032)

牙根吸收(root resorption)是正畸牙齒移動中常見并發(fā)癥之一，但其發(fā)病機制仍不清楚［1－2］。有研究顯示:發(fā)生牙根吸收的區(qū)域局部牙周組織中白細胞介素－1β(interleukin－1β，IL－1β)的表達增強［3］，且局部牙周組織中細胞增多［4］。那么，這種局部牙周組織中增多的細胞是否受到局部炎癥牙周組織中某種趨化信號的作用呢?本研究針對這個問題進行了初步研究。

單核細胞趨化蛋白－1(Monocyte chemoattractant protein－1，MCP－1)是一種特異性趨化因子，對單核－巨噬細胞有很強的趨化激活作用，在趨化激活單核－巨噬細胞向炎癥部位募集過程中發(fā)揮重要作用［5］。Asano等［6］在大鼠牙根吸收組織切片中發(fā)現(xiàn):牙周膜成纖維細胞中MCP－1表達陽性，同時還觀察到，MCP－1能刺激大鼠破骨前體細胞向破骨細胞的轉(zhuǎn)化，但其具體的分子生物學機制仍不清楚。本研究分別采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT－PCR)、免疫熒光技術以及Western blot方法檢測不同濃度IL－1β對hPDLFs中MCP－1表達的影響，初步探討在牙根吸收過程中，人牙周膜成纖維細胞在IL－1β介導環(huán)境下，是否存在MCP－1的過表達、引起外周血單核細胞向發(fā)生牙根吸收的牙周組織中募集的機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

重組人IL－1β(Peprotech公司，美國);DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibco公司，美國);胎牛血清(Hyclone Lab，Inc);RT－PCR試劑盒、Taq DNA聚合酶、DL2 000 marker(Takala公司，日本);兔抗人MCP－1多克隆抗體(Abcom公司，美國);山羊抗兔熒光素FITC標記抗體(北京中衫金橋生物技術有限公司);EPS 500/400電泳儀(PerkinElmer公司，美國);垂直電泳槽和電泳儀、Mini Trans－Blot轉(zhuǎn)移電泳槽、Biorad PCR熱循環(huán)儀(Bio－Rad公司，美國)。Olympus－BH－2型光學顯微鏡(Olympus公司，日本);Zeiss Axioimager M1型顯微鏡(ZEISS公司，德國)

1.2 方法

1.2.1 人牙周膜成纖維細胞(hPDLFs)的體外培養(yǎng)

選取12～18歲志愿者因正畸需要拔除的健康前磨牙，立即放入取材液中，超凈工作臺內(nèi)用含雙抗(青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL)的無菌生理鹽水反復沖洗后，刮取根中1/3牙周膜組織，參照文獻［7－8］采用組織塊法進行原代培養(yǎng)，常規(guī)傳代并經(jīng)免疫組化方法鑒定其來源后用于以下實驗。

1.2.2 實驗分組和細胞處理

取生長良好的4～6代hPDLFs細胞，胰蛋白酶消化后以1×105/mL的細胞密度分別接種于6孔培養(yǎng)板、預先置有玻片的24孔培養(yǎng)板及25 mL的培養(yǎng)瓶中，用含100 mL/L FBS的DMEM－F12的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。待細胞充分貼壁并達80%匯合時換用無血清DMEM－F12繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞相對同步化。然后分別取出6孔、24孔板以及培養(yǎng)瓶，棄培養(yǎng)液，無血清DMEM－F12洗2遍后，各隨機分為5組(1個對照組和4個實驗組)，對照組(N組)加入不含IL－1β的DMEM－F12;4個實驗組分別加入含IL－1β終末濃度為1 ng/mL(1組)、5 ng/mL(2組)、10 ng/mL(3組)、25 ng/mL(4組)的DMEM－F12，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。6孔板細胞用于RT－PCR;24孔板每孔中細胞爬片用于免疫熒光染色;25 mL培養(yǎng)瓶細胞用于western blot檢測，實驗共重復3次。

1.2.3 RT－PCR檢測MCP－1基因的表達

取上述培養(yǎng)的6孔板，提取各孔hPDLFs的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA，PCR擴增，產(chǎn)物用18 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR反應所用引物設計如下。MCP－1上游引物:5’－CTTCTGTGCCTGCTGCTCATA－3’，下游引物5’－CTTTGGGACACTTGCTGCTG－3’，產(chǎn)物大小166 bp;以磷酸甘油醛脫氫酶(glyceradehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因作為內(nèi)參照，GAPDH上游引物:5’－CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT－3’，下游引物:5’－AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC－3’，產(chǎn)物大小306 bp。反應體系共25 μL。反應條件: MCP－1，94℃預變性5 min，1個循環(huán);94℃變性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)。GAPDH，94℃預變性5 min，1個循環(huán);94℃變性35 s，58℃退火60 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)。所有循環(huán)最后均72℃延伸10 min。取 PCR各產(chǎn)物經(jīng)18 g/L瓊脂糖凝膠電泳30 min后，于紫外線箱中觀察并照相記錄。產(chǎn)物鑒定以DL2 000 marker為標準。利用Image－Pro Plus圖像分析軟件，對目的基因和參照基因電泳條帶進行灰度掃描，分別計算出不同處理組中MCP－1與GAPDH的灰度比值，將該比值作為反映不同處理組中MCP－1的基因表達水平指標。

1.2.4 免疫熒光染色檢測MCP－1的蛋白表達

取上述培養(yǎng)的24孔板細胞爬片經(jīng)40 g/L多聚甲醛室溫固定后，用PBS振洗3次，每次5 min，吹干，滴加兔抗人MCP－1多克隆抗體(1∶50稀釋)，置于濕盒4℃冰箱過夜，PBS振洗3次，每次5 min，吹干，滴加山羊抗兔熒光素FITC標記抗體(1∶250稀釋)，置濕盒室溫下2 h，PBS振洗3次，每次5 min，吹干，滴加DAPI染色液，PBS振洗后，抗熒光淬滅封片液封片，PBS代替一抗作陰性對照，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.5 Western blot檢測MCP－1蛋白的表達

取上述培養(yǎng)的25 mL培養(yǎng)瓶，提取每瓶hPDLFs中總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，經(jīng)150 g/L SDS－PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinglidence fluoride，PVDF)膜上，用含50 g/L脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉2 h。將封閉好的PVDF膜封入加有一抗(兔抗人MCP－1多克隆抗體按1∶500稀釋;抗β－actin單克隆抗體1∶1 000稀釋)的塑料袋中，室溫孵育1 h之后4℃冰箱過夜。PVDF膜經(jīng)TBST漂洗3次(每次10 min)后，分別與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG室溫孵育1 h，電化學發(fā)光，拍照，以β－肌動蛋白(β－actin)作為內(nèi)參照，掃描后圖片利用Image－Pro Plus圖像分析軟件進行灰度掃描，分別計算出不同處理組中MCP－1與β－actin的灰度比值，將該比值作為反映不同處理組中MCP－1蛋白的相對表達水平指標。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析及SNK－q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RT－PCR結果

MCP－1 PCR產(chǎn)物電泳結果顯示，對照組hPDLFs中，MCP－1mRNA有弱表達;實驗組hPDLFs隨著IL－1β作用濃度的升高，MCP－1mRNA表達明顯增高(圖1)。當IL－1β達10 ng/mL和25 ng/mL時，其表達與正常對照組相比有顯著差異(P＜0.05)，但兩者之間無明顯的統(tǒng)計學差異(P＞0.05);而低濃度IL－1β(1 ng/ml和5 ng/mL)作用下，hPDLFs中MCP－1mRNA表達與對照組相比無顯著差異性(P＞0.05)(表1)。

圖1 MCP－1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

表1 不同處理組中MCP－1/GAPDH的灰度比值的比較 (n=8，±s)

表1 不同處理組中MCP－1/GAPDH的灰度比值的比較 (n=8，±s)

a.與對照組比較P＜0.05;b.與10 ng/mL組比較P＜0.05

IL－1βMCP－1/GAPDH對照組 0.804±0.018b 1ng/mL 0.807±0.013b 5ng/mL 0.817±0.017b 10ng/mL 0.957±0.010a 25ng/mL 0.948±0.029a

2.2 免疫熒光染色結果

對照組hPDLFs中，MCP－1呈陰性或弱陽性表達;5 ng/mL IL－1β作用下，hPDLFs中MCP－1呈陽性表達;在10 ng/mL IL－1β作用下，MCP－1呈強陽性表達，主要在細胞漿中表達，陽性細胞數(shù)顯著增加(圖2)。

圖2 MCP－1免疫熒光染色圖(×200)

2.3 Western blot結果

對照組hPDLFs中MCP－1蛋白有弱表達，隨著IL－1β濃度的升高，其表達明顯增高，與免疫熒光染色結果一致(圖3)。當IL－1β達10 ng/mL和25 ng/mL時，其表達與正常對照組相比有顯著差異(P＜0.05)，但兩者之間無明顯的統(tǒng)計學差異(P＞0.05);而低濃度IL－1β(1 ng/mL和5 ng/mL)作用下，hPDLFs中MCP－1蛋白表達與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)(表2)。

圖3 MCP－1蛋白表達Western blot檢測圖

表2 不同處理組中MCP－1/β－actin的灰度比值的比較 (n=8，±s)

表2 不同處理組中MCP－1/β－actin的灰度比值的比較 (n=8，±s)

a.與對照組比較P＜0.05;b.與10 ng/mL組比較P＜0.05

IL－1β MCP－1/β－actin對照組 0.408±0.029b 1 ng/mL 0.409±0.021b 5 ng/mL 0.424±0.046b 10 ng/mL 0.929±0.033a 25 ng/mL 0.920±0.037a

以上結果表明:對照組hPDLFs中可見微弱的MCP－1表達，且主要在細胞漿表達;低濃度IL－1β作用下，對hPDLFs中MCP－1表達的調(diào)節(jié)作用較對照組不明顯(P＞0.05);隨著IL－1β作用濃度的增加，hPDLFs中MCP－1表達出現(xiàn)明顯的上調(diào)表現(xiàn)，這種上調(diào)表現(xiàn)在10 ng/mL IL－1β的作用濃度時最明顯(P＜0.05)。

3 討論

趨化因子(Chemokines)是一組可由多種細胞產(chǎn)生的小分子蛋白，能特異性地趨化白細胞，從而參與多種口腔、全身免疫炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展［5，9］。單核細胞趨化蛋白－1(MCP－1)是趨化因子家族中的重要成員之一，是被證實的趨化單核細胞向炎癥部位募集的主要因子［10］。牙根吸收作為正畸牙齒移動過程中常見的并發(fā)癥，其后果較為嚴重，已經(jīng)引起廣泛的關注。普遍觀點認為正畸過程中引起的牙根吸收是一種多細胞多因子共同參與的免疫炎癥反應［1－2］，在此過程中單核－巨噬細胞系細胞對局部壞死組織的清除發(fā)揮著重要的作用［11－13］。Brudvik P等［11－12］在大鼠牙根吸收模型石蠟切片中發(fā)現(xiàn):牙根吸收側(cè)有大量單核－巨噬細胞樣細胞存在，同時提出這些細胞的聚集與活化可能受到炎癥牙周組織中某種趨化信號的作用;張斯等［3］發(fā)現(xiàn):發(fā)生牙根吸收區(qū)域局部的牙周組織中IL－1β表達增強;李楠等［4］發(fā)現(xiàn):牙根吸收側(cè)局部牙周組織中細胞增多。那么，參與牙根吸收過程中的大量單核細胞－巨噬細胞樣細胞是如何聚集到牙根吸收局部組織中的呢?是否存在hPDLFs在IL－1β作用下，通過上調(diào)MCP－1表達引起外周血中單核細胞向局部炎癥組織募集的機制呢?針對這個問題，本研究通過免疫熒光染色方法對hPDLFs中MCP－1的蛋白表達進行了定性研究，明確MCP－1在正常hPDLFs可微弱表達，且主要表達于細胞的胞漿中，這與Nebel D等［14］研究結果一致，同時觀察到 IL－1β可以明顯上調(diào) hPDLFs中MCP－1的表達。進一步通過定量分析發(fā)現(xiàn):低濃度(1 ng/mL和5 ng/mL)的 IL－1β對 hPDLFs中MCP－1表達的調(diào)節(jié)作用不明顯(P＞0.05)，隨著IL－1β作用濃度的增高，可以明顯上調(diào)hPDLFs中MCP－1表達，這與Oqura N等［15］在顳下頜關節(jié)滑膜細胞中的研究結果一致。

本結果提示，存在于牙根吸收發(fā)生過程中的IL－1β介導環(huán)境，可使hPDLFs中MCP－1表達增高，而MCP－1表達增高可能是引起外周血單核細胞向局部募集的機制之一。Asano M等［6］研究發(fā)現(xiàn):MCP－1在鼠牙根吸收側(cè)表達陽性，陽性細胞主要為成纖維樣細胞，同時還觀察到MCP－1能刺激大鼠破骨前體細胞向破骨細胞轉(zhuǎn)化，這與本結果顯示的hPDLFs在炎癥環(huán)境下，通過調(diào)節(jié)MCP－1的表達，參與趨化單核細胞的募集機制一致。而IL－1β對hPDLFs中MCP－1調(diào)節(jié)作用的信號通路，以及IL－1β刺激下hPDLFs分泌的MCP－1對單核細胞的趨化作用有何影響?具體是否通過激活單核細胞中其受體CCR2的表達來發(fā)揮作用等具體的機制還有待進一步的研究。

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