邢 進，吳 軍，岳秉飛，賀爭鳴

（1.軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所，北京100071；2.中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京100050）

綠膿桿菌又稱銅綠假單胞菌，革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于環(huán)境（如水、土壤）、植物和動物中［1］。綠膿桿菌是醫(yī)院最常見機會致病菌之一［2］，也是無特定病原體（SPF）動物必須排除的病原菌之一。在免疫功能正常的小鼠體內，綠膿桿菌不會致病，但是對免疫功能低下的動物，如注射免疫抑制劑、燒傷研究和全身輻照等，以及免疫缺陷動物模型，就很容易受到感染而出現(xiàn)敗血癥，導致死亡［3、4］，嚴重干擾動物實驗的進行，影響實驗數(shù)據(jù)和結果的可靠性和準確性。因此，了解和掌握綠膿桿菌在實驗動物和實驗動物設施中綠膿桿菌的分型情況，有助于控制該菌在實驗動物中的傳播和對動物實驗的影響。本實驗采用多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析（multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis，MLVA）方法對近幾年在實驗動物中分離到的141株綠膿桿菌分離株進行分型研究。

1 材料和方法

1.1 綠膿桿菌菌株

標準菌種ATCC 27853和PAO1株ATCC 47085，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。分離株共141株，編號為Pa1～Pa143（Pa73和Pa129為空號）分離自17個不同的實驗動物生產和使用單位（分別編號為L1～L17）。其中133株分離自北京地區(qū)實驗動物生產和使用單位中小鼠、大鼠、豚鼠和兔；2株分離自河北省的小鼠；6株分離自北京地區(qū)部分實驗動物設施中的飲水樣品。

1.2 主要試劑和儀器

MH瓊脂培養(yǎng)基購自BD公司；PCR相關試劑購自TAKARA生物工程公司；根據(jù)參考文獻［5］合成引物ms77，ms127，ms142，ms172，ms211，ms212，ms213，ms214，ms215，ms216，ms217，ms222，ms223，由上海生物工程公司合成。毛細管電泳儀（Qiagen QIAxcel），BioNumerics軟件6.6版本。

1.3 綠膿桿菌DNA的制備

將綠膿桿菌分離株接種于MH培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)18 h，用滅菌棉簽取適量菌落懸浮于無菌PBS中，采用加熱法提取菌落DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 多位點串聯(lián)重復序列（MLVA）分析

根據(jù)文獻［5，6］和MLVA數(shù)據(jù)庫［7］，篩選13個串聯(lián)重復基因位點，見表1，對141株綠膿桿菌分離株和2株標準菌種的13個VNTR位點進行MLVA分析。

1.4.1 PCR反應體系 20μL反應體系：上下游引物（10μmol/L）各0.6μL，DNA模版0.5μL，dNTP （各2.5mmol/L）1.6μL，Taq酶（5 U/μL）0.2μL，10×Buffer（含Mg2+15 mmol/L）2μL，加滅菌水至20μL。

1.4.2 反應條件96℃預變性5 m in，95℃30 s，65℃30 s，72℃1 m in 30個循環(huán)，72℃延伸10 m in。

1.4.3 毛細管電泳使用高分辨力預制膠卡（QX DNA High Resolution Cartidge）電泳12 min，Size Marker使用100 bp～3 kb，A linement Marker使用50 bp～3 kb。

1.5 MLVA結果分析

13個位點可變數(shù)目重復序列（VNTR13）分析PCR產物經毛細管電泳，所得電泳圖用Biocalculator軟件進行圖像處理，然后用Bionumerics 6.6軟件進行分析，計算各VNTR數(shù)目，根據(jù)該特征數(shù)據(jù)，對各菌株間的相似度采用非加權組平均法（UPGMA）進行聚類分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹（UPGMA dendrogram），并繪制最小生成樹（minimum spanning tree，MST）。MLVA的分辨力用辛普森多樣性系數(shù)D（Simpson’s index of diversity）表示［8］，公式如下：注：N表示全部受試菌株的總數(shù)，nj表示菌株的分型數(shù)目。

2 結果

2.1 綠膿桿菌分離株MLVA的穩(wěn)定性和重復性

每次進行PCR均設標準菌株的對照，擴增片段大小或重復序列數(shù)與文獻和數(shù)據(jù)庫中的一致［5，7］。從分離株中抽取不同來源的20株菌，間隔1個月重復擴增3次，每次的擴增片段或重復序列數(shù)完全相同。

2.2 綠膿桿菌VNTR13多態(tài)性

本次試驗選取了13個VNTR位點對141株北京地區(qū)的實驗動物綠膿桿菌分離株進行MLVA基因分型，如兩個標準菌株的電泳結果所示，如圖1、圖2所示。顯示出綠膿桿菌VNTR13的DNA指紋圖譜多態(tài)性。

2.3 聚類分析

表1 綠膿桿菌13個VNTR位點引物序列及重復片段大?。?］Tab.1 P.Aeruginosa 13 VNTRs loci primer sequences and repeat fragment size

圖1 PAO1株VNTR13的多態(tài)性Fig.1 Polymorphism of PAO1 strain VNTR13 Note：1，6，11，17.50bp DNA ladder marker；2～5.ms77，ms127，ms142，ms172；7～10.ms211，ms212，ms213，ms214；12～16.ms215，ms216，ms217，ms222，ms223.

圖2 ATCC27853 VNTR13的多態(tài)性Fig.2 Polymorphism of ATCC27853 strain VNTR13 Note：1，6，11，17.50bp DNA ladder marker；2～5.ms77，ms127，ms142，ms172；7～10.ms211，ms212，ms213，ms214；12～16.ms215，ms216，ms217，ms222，ms223.

2.3.1 VNTR13擴增各菌株的片段經過毛細管電泳儀電泳，圖像經Bionumerics6.6數(shù)據(jù)化處理分析后計算出各菌株的每個位點的重復序列數(shù)目。根據(jù)每株菌的13個重復序列數(shù)將143株（含ATCC27853和PAO1株）綠膿桿菌相同基因型合并，繪制精簡的系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。來自17個單位的141株綠膿桿菌分離株，共被分為A、B、C 3個大群56個基因型，基因型編號為MP1～56，見表2。根據(jù)公式計算VNTR13的分辨力系數(shù)為D=0.763。

表2 141株綠膿桿菌分離株分型情況Tab.2 The number of 141 P.aeruginosa isolates typing

圖3 北京地區(qū)綠膿桿菌MLVA分型結果聚類分析Fig.3 MLVA typing of P.aeruginosa in Beijing cluster analysis results注：143株綠膿桿菌（含ATCC27853和PAO1株）共分為A、B、C三個大群，56個基因型。圖片右側的菌株信息從左至右依次為：MLVA分型編號，同型菌株數(shù)量，隨后13列分別為VNTR位點ms77、ms127、ms142、ms172、ms211、ms212、ms213、ms214、ms215、ms216、ms217、ms222、ms223的重復序列數(shù)目。ATCC 27853和PAO1株作為分型對照Note：143 P.aeruginosa（including ATCC27853 and PAO1 strain）were divided into A，B，C three large group，56 genotypes.Strains right of the picture information from left to right：MLVA type number，the number of the same type of strain，respectively，followed by 13 locims77，ms127，ms142，ms172，ms211，ms212，ms213，ms214，ms215，ms216，ms217，ms222，ms223 number of repeat sequences.ATCC 27853 and PAO1 strains as a sub-type controls

2.4.2 用最小生成樹對所得菌株VNTR13特征數(shù)據(jù)進行聚類分析（彩插7見圖4）。從圖中可以看到所有菌株被分為了3大部分。其中A群所占比例最大，為116/141（82.3％），B群為18/141 （12.8％），C群為7/141（5.0％）。A群主要由L1～L3、L10～L15共9個來源的分離菌組成。B群主要由L2、L3、L5、L6、L15和L16共6個來源的分離菌組成。C群主要由L2～L4、L7～L9和L14共7個來源的分離菌組成。標準菌株PAO1歸屬于C群，ATCC27853屬于A群，但同源關系較遠。A群中以MP9和MP10分型為主。其他菌株均呈散在分布。

在141株分離株中，Pa71～Pa77（Pa73為空號）是不同來源動物飲水樣品，分型編號為MP20～MP25，在3個群中均有分布，MP20、MP21屬于B群，MP23、MP24屬于C群，MP25屬于A群。

Pa142和Pa143（MLVA分型編號MP51）分離自L17，為河北省石家莊市，其同源性與Pa123（分型編號MP44），同源性高達85.9％。

Pa015～021、024～030、033～043、046～052、056～057、060～067、080、085、088～089、092～097、108～120、124～127，分別分離自L2、L12和L13，分離株數(shù)最多，分型完全相同。Pa023和Pa099分離自兩個不同的單位，L2和L14，分型完全相同，分型編號為MP12。其他分離地點的分離株分型相對獨立，無區(qū)域性同源關系。

3 討論

綠膿桿菌的基因分型方法主要有MLVA方法、脈沖場電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）方法［9，10，11］，以及多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）方法等［12］。與后兩者相比，MLVA分型方法在分性能力、試驗效率、自動化程度、重復性和成本等因素都是比較理想的分型方法［12，13］。本研究中所得到的56種基因分型通過與數(shù)據(jù)庫［7］比對，其中MP49（Pa133）和MP55（Pa139）分別與利比亞的1株和西班牙的1株分離株僅有2個位點的不同，同源性最高；其次是MP5（Pa005）、MP25（Pa077）、MP38（Pa104）和MP41（Pa107）分別與分離自法國的4株菌株有3個位點的差異；MP54 （Pa137～138、140）與分離自西班牙的1株分離株有3個位點的差異。其他分型與數(shù)據(jù)庫中比對的結果，位點差異均在3個以上。本研究的MLVA結果已經上傳至此數(shù)據(jù)庫，名稱為P.aeruginosa2011_ Beijing。由此可以將所得的重復序列數(shù)目結果共享，與國內外的分離株進行比對，對于病原菌流行病學分析具有很好的應用價值。

目前國內還沒有應用MLVA方法對實驗動物中綠膿桿菌分型的報道，MLVA基因分型方法日漸成熟，近兩年已經有很多關于大腸桿菌［14］、布魯氏菌［15］、鼠疫耶爾森氏菌［16］、煙曲霉菌［17］等病原菌的MLVA方法分型的報道。在綠膿桿菌的分型分析中，一般常用的有15個VNTR位點，本次實驗所選擇的13個位點的重復序列大小均在15 bp以上，不需要進行測序就能夠測定其片段大小。

根據(jù)最小生成樹（MST）的結果可以發(fā)現(xiàn)，北京地區(qū)的綠膿桿菌分離株主要分為3個大群，其中A群的比例最大，占到了82.3％，B群占12.8％，C群占5.0％。A群基因型中MP9有11株，MP10有69株，這與不同來源動物的檢測數(shù)量有一定關系。在菌株來源中，L2中的分離菌株在3個群中均有分布，表明此單位的綠膿桿菌污染源來自于不同方面?？傮w分析，其他各來源分離株基本呈現(xiàn)散在分布，大多為一株一型，表明北京地區(qū)動物設施內的綠膿桿菌分離株多態(tài)性比較豐富。因此更需要我們引起對該菌的重視。

本次試驗中水中分離株與動物分離株分型并不完全相同，只是具備較近的同源關系，能夠證明飲水的污染是實驗動物綠膿桿菌感染的重要原因之一。大部分分離株保持了比較獨立的基因型，而L3的分離株呈明顯散在分布，這可能與動物使用單位不繁殖動物，所用實驗動物均從外部購買有關。實驗動物設施是相對封閉的環(huán)境，同時都有著比較嚴格的凈化措施，從結果看，同一區(qū)域的分離株并沒有較近的同源性，反倒是不同區(qū)域的分離株存在一定的同源性。說明實驗動物的引進和交流會引起綠膿桿菌對本實驗室或實驗動物設施的污染。由此可見，通過MLVA方法可以方便的對本實驗室和動物設施的綠膿桿菌污染進行分子流行病學的臨床監(jiān)測，追溯污染源，便于實驗室的評價。

［1］Goldberg JB，Pseudomonas：global bacteria［J］.Trends Microbiol.2000，8（2）：55-57.

［2］Campa M，Bendinelli M，F(xiàn)riedman H（eds.）.Pseudomonas aeruginosa as an Opportunistic Infection［M］.New York：Plenum Press，1993，1-18.

［3］Hammond CW，Tompkins M，Miller CP，et al.Studies on the susceptibility to infection following ionizing radiation.I.The time of onset and duration of the endogenous bacteremias in mice［J］.J.Exp.Med.1954，99（5）：405-410.

［4］Dietrich HM，Khaschabi D，Albini B.Isolation of Enterococcus durans and Pseudomonas aeruginosa in a scid mouse colony［J］.Lab Anim，1996，30（2）：102-107.

［5］Vu-Thien H，Corbineau G，Hormigos K.Multiple-Locus Variable-Number Tandem-Repeat Analysis forLongitudinal Survey of Sources of Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Patients［J］.JClin Microbiol.2007，45（10）：3175-3183.

［6］Onteniente L，Brisse S，Tassios PT，et al.Evaluation of the Polymorphisms Associated with Tandem Repeats for Pseudomonas aeruginosa Strain Typing［J］.JClin Microbiol，2003，41（11）：4991-4997.

［7］MLVA bank.http：//minisatellites u-psud fr/MLVAnet/.

［8］Hunter PR，Gaston MA.Numerical Index of the Discriminatory Ability of Typing Systems：an App lication of Simpson＇s Index of Diversity［J］.J Clin Microbiol，1988，Nov.26（11）：2465 -2466.

［9］Botes J，Williamson G，Sinickas V，et al.Genomic typing of Pseudomonas aeruginosa isolates by comparison of riboprinting and PFGE：correlation of experimental Results with those predicted from the complete genome sequence of isolate PAO1［J］.JMicrobiol Methods，2003，55（1）：231-240.

［10］Anthony M，Rose B，Pegler MB，et al.Genetic Analysis of Pseudomonas aeruginosa Isolates from the Sputa of Australian Adult Cystic Fibrosis Patients［J］.J Clin Microbiol，2002，40 （8）：2772-2778.

［11］Grundmann H，Schneider C，Hartung D，et al.Discriminatory power of three DNA-based typing techniques for Pseudomonas aeruginosa［J］.JClin Microbiol，1995，33（3）：528-534.

［12］van Mansfeld R，Jongerden I，Bootsma M，et al.The Population Genetics of Pseudomonas aeruginosa Isolates from Different Patient Populations Exhibits High-Level Host Specificity［J］.PLoSOne，2010，5（10）：e13482.

［13］van Belkum A，Struelens M，De Visser A，et al.Role of genomic typing in taxonomy，evolutionary genetics，and microbial epidemiology［J］.JClin Microbiol，2001，14（3）：547-560.

［14］Murphy M，Minihan D，Buck ley JF，et al.Multiple-locus variable number of tandem repeat analysis（MLVA）of Irish verocytotoxigenic Escherichia coli O157 from feedlot cattle：uncovering strain dissemination routes［J］.BMC Vet Res，2008，4：2.

［15］Her M，Kang SI，Kim JW，et al.A Genetic Comparison of Brucella abortus Isolates from Animals and Humans by Using the MLVA Assay［J］.J.Microbiol.Biotechnol.2010，20（12）：1750-1755.

［16］Zhang XA，Hai R，Wei JC，et al.MLVA distribution characteristics of Yersinia pestis in China and the correlation analysis［J］.BMC Microbiol，2009，9：205.

［17］Thierry S，Wang DY，Arne P，et al.Multip le-locus variablenumber tandem repeat analysis formolecular typing of Aspergillus fumigatus［J］.BMC Microbiol，2010，10：315.