姜 玲，謝青軒，虢婷婷，阮 穎

（湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128）

組蛋白甲基化作為一個重要的表觀遺傳學標記[1]，對植物開花起調控作用[2]。擬南芥SDG8（SET DOMAIN GROUP 8）編碼的是一種組蛋白甲基轉移酶[3]，約含有1 806個氨基酸序列，能特異催化組蛋白H3K36的雙、三甲基化，是FLC表達所需的表觀遺傳記憶密碼之一，在抑制植物早花過程中起重要作用[4]。功能缺失的擬南芥sdg8突變體[5-6]36的雙、三甲基化水平顯著降低，開花調控的關鍵轉錄因子FLC的轉錄激活受到抑制[7]，進而植株表現(xiàn)為早花表型[8]。

BraSDG8是湖南農(nóng)業(yè)大學植物發(fā)育與表觀遺傳調控研究室在白菜型油菜中克隆的擬南芥SDG8的同源基因，cDNA全長4 963 bp，編碼1 654個氨基酸，結構域的組成與擬南芥SDG8完全一致，包含 AWS（associated with SET）domain、SET domain和Post SET domain 3個結構域，同屬于ASH1家族，推測BraSDG8與SDG8具有相似的生物學功能[9]。筆者通過構建pFGC5941-BraSDG8 RNA干擾載體及農(nóng)桿菌介導的擬南芥遺傳轉化，旨在為進一步研究白菜型油菜BraSDGG8的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）哥倫比亞生態(tài)型Col，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，農(nóng)桿菌（A－grobacterium tumefaciens）GV3101 和 pFGC5941 表達載體由湖南農(nóng)業(yè)大學植物發(fā)育與表觀遺傳調控實驗室保存；pMD-19 T Vector購自TAKARA公司。

1.2 方法

1.2.1 BraSDG8-1片段的擴增 比對擬南芥SDG8和BraSDG8 cDNA序列，根據(jù)保守區(qū)域設計引物，分別在5′端導入2個酶切位點（AscⅠ/BamHⅠ），預計擴增產(chǎn)物大小為443 bp，引物序列如下。

BraSDG8-1 F：5′-GGCGCGCCGGATCCCCAAG CATCAAGTGGCTCT-3′（NcoⅠ/XbaⅠ）

BraSDG8-1 R：5′-CCATGGTCTAGAGCACAGA GTTGATAACTTCTGAATCTGGT-3′

PCR擴增（Tm=57℃），回收片段，連接至pMD19-T載體構建成pMD19-T-BraSDG8-1，熱激法轉化大腸桿菌DH5α，將陽性菌落經(jīng)PCR驗證后送博尚生物公司測序，所得結果在The Brassica database（BRAD）上進行序列比對分析。

1.2.2 BraSDG8 RNA干擾載體的構建 如圖1所示，BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切載體pMD19-TBraSDG8-1和pFGC5941，將目的片段反向插入至查爾酮內(nèi)含子與Ocs終止子之間，構建表達載體p-BraSDG8-1；然后AscⅠ和NcoⅠ雙酶切載體pMD19-T-BraSDG8-1和p-BraSDG8-1，將目的片段正向插入至35 S啟動子與查爾酮內(nèi)含子之間，構建BraSDG8 RNA干擾載體，記為p-BraSDG8。

將構建好的RNA干擾載體分別導入大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌GV3101中，測序驗證。

1.2.3 擬南芥的遺傳轉化 采用浸花法將p-BraSDG8載體轉化野生型擬南芥Col生態(tài)型。通過卡那霉素（濃度為40 mg/L）篩選獲得抗性苗，改良的CTAB法提取葉片總DNA，PCR檢測。引物序列如下。

35s825F：5′-ATCCCACTATCCTTCGCAAGACC CTT-3′

Intron825R：5′-TGACTCCATCTTATTCCCTCCG TTTC-3′

2 結果與分析

2.1 BraSDG8-1干擾片段的克隆與檢測

克隆得到440 bp左右的目的片段，將目的片段連接至pMD19-T載體上，通過熱激法轉至大腸桿菌DH5α中，獲得陽性菌落，PCR檢測片段為440 bp左右，符合預期片段大?。▓D2）。

將目的片段測序，測序結果與RNA干擾片段進行序列比對，同源性達100%，MegAlign比對（圖3），BraSDG8-1基因片段序列完整正確，可用于后

2.2 干擾載體的酶切驗證

用BamHⅠ和XbaⅠ分別單酶切p-BraSDG8驗證（圖4），最終分別得到了1 300 bp和2 500 bp左右的條帶，符合預期片段大小，表明BraSDG8 RNA干擾載體p-BraSDG8構建成功。

2.3 轉化根癌農(nóng)桿菌的質粒PCR檢測

通過凍融法將干擾載體轉至根癌農(nóng)桿菌GV3101，提取陽性菌落質粒，進行質粒PCR檢測，擴增得到的條帶大小為400 bp左右（圖5），與設計的目的片段大小443 bp相符，說明干擾載體已轉化至根癌農(nóng)桿菌中。

2.4 抗性苗的PCR檢測

通過改良的CTAB法提取抗性苗總DNA，擴增結果如圖6，檢測得到1株陽性植株。片段大小與預期片段大小一致，為1 200 bp左右。

2.5 BraSDG8沉默的轉基因植株的表型觀察

在含有卡那霉素（濃度為40 mg/L）的MS培養(yǎng)基上，抗性苗生長健壯，子葉飽滿而呈綠色，根系發(fā)育正常，而非抗性苗子葉呈黃色，個體較小，根長相對短?。▓D7）。與野生型擬南芥Col生態(tài)型相比，在營養(yǎng)生長期，轉基因植株的蓮座葉數(shù)目以及生長狀態(tài)都沒有明顯區(qū)別；在生殖生長期，轉基因植株的花期并未縮短，只是花苔數(shù)目和果莢數(shù)目變少，每個果莢的結實率降低。

3 討 論

組蛋白甲基化作為一個重要的表觀遺傳學標記[10-11]，是植物發(fā)育過程中的重要調節(jié)方式，其主要是由組蛋白甲基轉移酶（histone methyltransferases，HMTs）來調控的[12-13]。其中，組蛋白賴氨酸甲基轉移酶（histone lysine methyltransferase，HLMT）是一類含有 SET（Su（var），Enhancer of zeste，Trithorax）結構域的家族[14]。進化上保守的SET結構域包含約130個氨基酸序列，形成一個結狀結構的酶催化中心[15]，通過催化組蛋白甲基化來影響染色體的結構進而調控基因的表達[16]。早前的研究顯示，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了約47個SET DOMAIN GROUP（SDG）基因[17]，分別命名為 SDG1～SDG47，其中 SDG8，SDG25，SDG27和SDG30編碼的SET結構域蛋白涉及植物開花時間的調控[18]。RNAi是研究基因功能的重要方法[19-20]。BraSDG8是擬南芥SDG8的同源基因，二者的相似性非常高，筆者通過構建干擾載體轉化擬南芥，在克隆得到BraSDG8全長cDNA序列的基礎上，選取其中一段保守片段構建RNA干擾載體pFGC5941-BraSDG8，并通過農(nóng)桿菌GV3101介導，浸花法轉化野生型擬南芥Col，獲得了穩(wěn)定遺傳的轉基因植株。但是與野生型擬南芥（Col）相比，該轉基因植株開花時間、植株大小、蓮座葉數(shù)目等表型并未有明顯差異，其具體的原因有待進一步研究。

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