石典花， 張姍姍， 孫立立*

(1.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟(jì)南250014;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250014)

甘遂為大戟科植物甘遂Euphorbia kansui T.N.Lion ex T.P.Wang.的干燥塊根［1］，別名主田、貓兒眼、苦澤、陵澤、甘藁、陵藁、九頭獅子草等［2］。主要產(chǎn)于陜西、山西、河南、山東、寧夏等地，以陜西產(chǎn)者質(zhì)量最佳。甘遂屬有毒中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為下品。2010年版中國(guó)藥典一部載甘遂具有瀉水逐飲，消腫散結(jié)的功效。用于水腫脹滿，胸腹積水，痰飲積聚，氣逆咳喘，二便不利，風(fēng)痰癲癇，癰腫瘡毒等［1］?，F(xiàn)代研究表明，甘遂化學(xué)成分具有抗腫瘤、抗生育、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等活性［3］。臨床常用于治療晚期食道癌、乳腺癌等惡性腫瘤以及慢性支氣管炎哮喘等癥［4］。

目前甘遂的炮制多以醋炙為主，但全國(guó)炮制工藝很不統(tǒng)一［5-10］，更無具體的量化參數(shù)，只是單純依靠老藥工炮制經(jīng)驗(yàn)，或單純依靠化學(xué)成分為指標(biāo)優(yōu)選工藝參數(shù)［11-12］，導(dǎo)致醋甘遂的質(zhì)量參差不齊，進(jìn)而影響了臨床療效。本研究在傳統(tǒng)制法的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)法，優(yōu)選最佳醋炙工藝，為醋甘遂的炮制和飲片的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2996 DAD檢測(cè)器;瑞士METTLER XS205 DU10-5電子天平 (梅特勒-托利多儀器上海有限公司);紅外溫度儀ST80(北京雷泰光電技術(shù)有限公司);數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 (金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠);電炒藥機(jī) (哈爾濱市測(cè)電器廠);MILLI—Q超純水純化系統(tǒng);RE—2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠);索氏提取器等。

1.2 試藥 乙腈為色譜純;乙酸乙酯、石油醚等均為分析純;龍門米醋 (北京王致和味滋康食品有限公司，生產(chǎn)日期201001272);甘遂藥材由安徽亳州滬譙中藥飲片廠提供，產(chǎn)地為陜西。

2 方法與結(jié)果

2.1 醋炙工藝的正交設(shè)計(jì) 在前期研究工作基礎(chǔ)上，確定了甘遂醋炙的主要影響因素為加醋量、炒制時(shí)間、炒制溫度，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)法，以外觀質(zhì)量和內(nèi)在質(zhì)量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用加權(quán)法進(jìn)行評(píng)分，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2.1.1 外觀質(zhì)量評(píng)分依據(jù)和標(biāo)準(zhǔn) 中藥飲片的外觀性狀評(píng)價(jià)是中醫(yī)藥寶貴經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，能較直觀的反映出飲片的質(zhì)量好壞，因此將其作為正交試驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。依據(jù)炮制專家的傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)制定醋甘遂的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)樣品的表面顏色、斷面顏色、著色是否均勻、焦斑數(shù)量及有無醋焦香氣等對(duì)醋甘遂進(jìn)行傳統(tǒng)質(zhì)量評(píng)分，質(zhì)量最好的為100分。

2.1.2 內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)及標(biāo)準(zhǔn) 甘遂是有毒中藥，經(jīng)醋炙后可降低其毒性，緩和其峻瀉之性，經(jīng)前期急性毒性試驗(yàn)和藥效實(shí)驗(yàn)研究表明，甘遂醋炙前后的毒效部位均是石油醚部位，因此采用HPLC梯度洗脫法對(duì)此部位進(jìn)行測(cè)定，選擇其中15個(gè)特征峰峰面積之和作為優(yōu)選甘遂最佳醋炙工藝的指標(biāo)之一。

2.1.3 正交試驗(yàn)因素、水平設(shè)計(jì) 見表1。

表1 甘遂醋炙因素、水平Tab.1 Fatorsand levelsofstir-fried KansuiRadix with vinegar

2.2 毒效部位HPLC特征圖譜研究

2.2.1 色譜條件 Diamonsil-C8(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱;柱溫30℃;流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸 (梯度洗脫，見表2);體積流量1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。

2.2.2 供試品溶液的制備 取醋甘遂粉末 (過四號(hào)篩)約10 g，精密稱定，置索氏提取器中，精密加入石油醚90 mL，加熱回流提取8 h，提取液減壓回收，殘?jiān)皿w積比為1∶1的石油醚和乙酸乙酯混合溶劑溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加混合溶劑至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

表2 梯度洗脫條件Tab.2 Conditions of gradient elution

2.2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn) 取醋甘遂 (正交4號(hào)樣品)供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別對(duì)其中15個(gè)特征色譜峰保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果，15個(gè)特征峰的保留時(shí)間和峰面積基本一致，RSD均小于3%，表明精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn) 取醋甘遂 (正交4號(hào)樣品)供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、8、12、24 h測(cè)定，分別對(duì)其中15個(gè)特征色譜峰保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果，15個(gè)特征峰的保留時(shí)間和峰面積基本一致，RSD均小于3%，表明24h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn) 取醋甘遂 (正交4號(hào)樣品)粉末6份 (過四號(hào)篩)，照供試品溶液的方法制備，依次測(cè)定，分別對(duì)其中15個(gè)特征峰保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果，15個(gè)特征峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于3%，表明重復(fù)性良好。

2.2.4 測(cè)定法 分別精密吸取供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。測(cè)定圖譜及特征峰標(biāo)識(shí)見圖1。

圖1 醋甘遂毒效部位HPLC特征圖譜Fig.1 HPLC characteristic chromatography of the toxic and effective part in stir-fried Kansui Radix with vinegar

2.3 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.3.1 正交試驗(yàn)樣品的制備 取大小均一的凈甘遂各100 g，共取9份，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，加入不同比例的醋拌勻，悶潤(rùn)，待醋吸干，置預(yù)熱至一定溫度的電炒藥鍋中，不斷翻炒，以紅外線測(cè)溫儀測(cè)量控制鍋底溫度，炒制相應(yīng)時(shí)間，取出，放涼，再精密稱取各醋炙品質(zhì)量，計(jì)算各炮制品得率。以上述確定的測(cè)定方法和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)不同條件下制備的醋甘遂進(jìn)行傳統(tǒng)質(zhì)量評(píng)分，對(duì)內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定。

2.3.2 外觀質(zhì)量評(píng)分 正交1～9號(hào)醋甘遂，一次性送給一位炮制專家進(jìn)行評(píng)定，9份樣品逐個(gè)打分，共請(qǐng)了3位專家評(píng)審，每個(gè)樣品的平均值作為外觀質(zhì)量的得分。

2.3.3 內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)的測(cè)定 照2.2項(xiàng)方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 樣品得率及特征峰面積之和測(cè)定結(jié)果Tab.3 Yield of samples and the sum of the characteristic peaks area

2.3.4 內(nèi)在質(zhì)量得分 根據(jù)與生品換算后各供試品特征峰峰面積之和與甘遂生品特征峰峰面積之和的比值 (結(jié)果見表3)并綜合考慮毒性和藥效的關(guān)系，認(rèn)為，比例段在0.80～0.95者為佳，其中規(guī)定比例為0.9為100分，0.80～0.95比例段每增加或減少0.01減2分，其他比例段每增加0.01減1分，具體見表4。

表4 得分表Tab.4 The table of score

2.3.5 綜合質(zhì)量評(píng)分 外觀質(zhì)量和甘遂毒效部位對(duì)醋甘遂有著同等重要的意義，因此兩者的加權(quán)系數(shù)均為0.5，綜合評(píng)分以下式計(jì)算:

綜合質(zhì)量評(píng)分=外觀質(zhì)量得分×0.5+毒效部位特征峰面積得分×0.5

各種條件下醋甘遂綜合評(píng)分結(jié)果見表5。方差分析見表6。

表5 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析表Tab.5 Results of L9(34)orthogonal test and visual analysis

表6 方差分析Tab.6 Variance analysis

2.3.6 試驗(yàn)結(jié)果分析

直觀分析由表5的極差 (R)可以看出，在該正交試驗(yàn)設(shè)定的因素、水平條件下，對(duì)綜合評(píng)分影響大小的因素進(jìn)行分析，依次為B＞C＞A，即B因素影響最大，其次為C因素，A因素影響最小;對(duì)A因素有k2＞k3＞k1，對(duì)B因素有k1＞k3＞k2，對(duì)C因素有k2＞k3＞k1。因此，對(duì)綜合質(zhì)量評(píng)分而言，最佳炮制工藝條件為A2B1C2。

方差分析 由表6可以看出，以A因素項(xiàng)為誤差，B因素的P＜0.01，表明B因素對(duì)醋甘遂質(zhì)量有極顯著性影響。

2.3.7 甘遂最佳醋炙工藝的確定 由上述試驗(yàn)結(jié)果可以得到，甘遂最佳醋炙工藝條件應(yīng)為A2B1C2，即:取凈甘遂適量，加入30%的醋，悶潤(rùn)，待醋吸干，置預(yù)熱至230℃電炒藥鍋內(nèi)，炒制30 min，取出，晾涼。

2.3.8 醋甘遂最佳炮制工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 為考察正交試驗(yàn)的合理性和可重復(fù)性，用同一電炒藥鍋和同一批甘遂，進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。取凈甘遂3份，每份1 kg，加入0.3 kg的醋，悶潤(rùn)，待醋吸干，置預(yù)熱至230℃電炒藥鍋內(nèi)，炒制30 min，取出，晾涼，再精密稱取各醋炙品質(zhì)量，計(jì)算各炮制品得率?？疾齑赘仕斓耐庥^質(zhì)量，并進(jìn)行醋甘遂毒效部位特征圖譜測(cè)定。3批工藝驗(yàn)證試驗(yàn)的主要數(shù)據(jù)見表7。

表7 甘遂醋炙工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Results of validation test of the technology of Kansui Radix stir-fried with vinegar

3批驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，醋甘遂的得率約為94%，醋炙后甘遂外觀性狀與傳統(tǒng)外觀性狀評(píng)價(jià)保持一致，醋甘遂毒效部位特征峰面積之和基本一致，說明正交試驗(yàn)確定的工藝穩(wěn)定，可重復(fù)性強(qiáng)。

3 小結(jié)與討論

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)甘遂醋炙減毒增效原理，根據(jù)前期研究確定的甘遂毒效部位的HPLC特征指紋圖譜分析條件，對(duì)此部位進(jìn)行測(cè)定，并以此為指標(biāo)，結(jié)合醋甘遂的傳統(tǒng)外觀質(zhì)量，采用綜合質(zhì)量評(píng)分法，對(duì)醋甘遂的炮制工藝進(jìn)行優(yōu)選，這種方法較單純采用甘遂中某一成分為指標(biāo)來優(yōu)選甘遂醋制工藝的方法更加科學(xué)，合理，更能夠客觀的反映各個(gè)因素水平對(duì)醋甘遂質(zhì)量的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甘遂最佳醋炙工藝為:取凈甘遂適量，加入相當(dāng)于藥材量30%的醋，悶潤(rùn)，待醋吸干，置預(yù)熱至230℃電炒藥鍋內(nèi)，炒制30 min，取出，晾涼。經(jīng)3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明該工藝穩(wěn)定，可重復(fù)性強(qiáng)，優(yōu)選出的醋甘遂最佳炮制工藝，明確了加醋量、炒制溫度和炒制時(shí)間等炮制參數(shù)，可為規(guī)范醋甘遂生產(chǎn)，有效控制醋甘遂質(zhì)量提供理論依據(jù)。

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