陳 江 劉漢梅 黃玉碧，3

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所1，雅安 625014)

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命理學(xué)院2，雅安 625014)

(西南作物基因資源與遺傳改良教育部重點實驗室3，雅安 625014)

玉米淀粉合成焦磷酸化酶研究進展

陳 江1劉漢梅2黃玉碧1，3

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所1，雅安 625014)

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命理學(xué)院2，雅安 625014)

(西南作物基因資源與遺傳改良教育部重點實驗室3，雅安 625014)

玉米是重要的食用、飼用和工業(yè)原料，淀粉是玉米種子的主要組成部分，其生物合成和積累主要由ADPG焦磷酸化酶(ADP－Glc pyrophosphorylase，AGPase)、淀粉合成酶(starch synthase，SS)、淀粉分支酶(starch branching enzyme，SBE)及去分支酶(de－branching enzyme，DBE)等一系列的酶催化形成。ADPG焦磷酸化酶作為淀粉合成代謝途徑中關(guān)鍵限速酶，在玉米淀粉合成過程起到重要作用。通過對其深入研究，在揭示玉米淀粉生物合成的分子機理，實現(xiàn)玉米淀粉合成的人工調(diào)控等方面有重要意義。就玉米AGPase的理化性質(zhì)，調(diào)控特性，表達規(guī)律及在育種中的應(yīng)用進行綜述，對研究中存在問題及未來AGPase的研究方向提出見解。

玉米 淀粉生物合成 ADPG焦磷酸化酶 生物特性

玉米是世界第三大糧食作物，僅次于小麥和水稻。我國是世界上玉米生產(chǎn)第二大國，2010年全國玉米播種面積4.71億畝，產(chǎn)量達到17 725萬噸［1］。玉米在國民經(jīng)濟中占有重點地位，是重要的糧、飼和工業(yè)原料作物。淀粉是玉米種子的主要組成部分，占干種子的70%左右，其生物合成和積累主要發(fā)生在植物種子發(fā)育的特定階段，主要由ADPG焦磷酸化酶(ADP －Glc pyrophosphorylase，AGPase)、淀粉合成酶 (starch synthase，SS)、淀粉分支酶 (starch branching enzyme，SBE)及去分支酶(de－branching enzyme，DBE)等一系列的酶催化形成。AGPase是淀粉合成的起始酶，是淀粉合成代謝途徑中關(guān)鍵限速酶。其催化淀粉合成前體底物ADPG焦磷酸葡萄糖的形成，直接影響淀粉形成［2］，在淀粉合成過程中起到重要作用。通過對其深入研究，對揭示淀粉生物合成的分子機理，實現(xiàn)淀粉合成的人工調(diào)控具有重要意義。

國外從20世紀(jì)90年代中期開始，對玉米淀粉合成中的各個關(guān)鍵酶進行了深入的研究。通過對突變體的研究，成功克隆了許多淀粉合成相關(guān)基因［3］。隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，對淀粉代謝合成途徑有了更深的認(rèn)識。特別是淀粉合成焦磷酸化酶AGPGase的研究，在生產(chǎn)實踐已有成功運用［4－5］。為全面了解ADPG焦磷酸化酶相關(guān)性質(zhì)，本文綜述了當(dāng)前玉米AGPase理化性質(zhì)，調(diào)控特性，表達規(guī)律及在育種中的應(yīng)用，同時對研究中存在問題及未來AGPase的研究方向提出自己見解。

1 AGPase發(fā)現(xiàn)及命名

AGPase最初由 Espada［6］于1962 年在小麥胚乳中發(fā)現(xiàn)，Dickinson等［2］對玉米胚乳中AGPase理化性質(zhì)進行了初步研究。在植物光合組織和非光合組織中都能檢測到AGPase活性的存在，其催化淀粉合成代謝所需前體物質(zhì)ADP－Glc的形成。作為淀粉合成過程中限速酶［7］，在調(diào)節(jié)光合效率，影響作物產(chǎn)量上扮演了重要角色。

Dickinson等［2］在玉米胚乳突變體研究中，發(fā)現(xiàn)了2個突變體，其玉米籽粒在形態(tài)上與正常玉米籽粒不同，其中一個突變體玉米籽粒表面出現(xiàn)明顯皺縮，而另外一個籽粒比正常玉米容易研碎。為了和之前發(fā)現(xiàn)的Shrunken－1和Brittle－1突變體區(qū)別，分別將新發(fā)現(xiàn)的兩個突變體命名為Shrunken－2和Brittle－2。在這2個突變體中都缺失AGPase活性，因而用Shrunken－2(Sh2)和 Brittle－2(Bt2)來表示編碼玉米AGPase基因。研究證實，Shrunken－2突變株AGPase活性缺失是由于編碼AGPase大亞基基因的突變，而Brittle－2突變株則導(dǎo)致了AGPase小亞基基因的突變，因而分別用Shrunken－2(Sh2)表示編碼AGPase大亞基基因，Brittle－2(Bt2)表示編碼 AGPase小亞基基因。在隨后突變體研究中，相繼發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致AGPase活性缺失的其他突變基因，研究者按發(fā)現(xiàn)突變體順序標(biāo)號將AGPase基因區(qū)別，如AGP－1等［8］。

為了使 AGPase的命名更具普遍性，Herbers等［9］曾采用將AGPase編碼的大亞基用AGPase－L表示，而將AGPase編碼的小亞基用AGPase－S表示。Prioul等［10］為了區(qū)分不同組織 AGPase，建議用葉子的英文簡寫L加編號來命名葉片中的AGPase。Hannah等［11］進一步使用了這種命名方法來區(qū)分玉米不同組織編碼AGPase的基因，將編碼玉米葉片中的 AGPase 基因命名為 Agplzm(AGP，leaf，Zea mays)，編碼胚AGPase基因的命名為Agpemzm。根據(jù)AGPase細(xì)胞內(nèi)的分布，可將AGPase進一步分為胞質(zhì)型(cytosolic)和質(zhì)體型(plastidial)兩種類型［12］，編碼AGPase的亞基則有胞質(zhì)型小亞基(cytosolic small subunit，SSUⅠ)、質(zhì)體型小亞基(plastidial small subunit，SSUⅡ)、胞質(zhì)型大亞基(cytosolic large subunit，LSUⅠ)和質(zhì)體型大亞基(plastidial large subunit，LSUⅡ)，對應(yīng)編碼的基因則寫為SSUⅠ，SSUⅡ;LSUⅠ，LSUⅡ［13］，當(dāng)前文獻中多用此對編碼不同類型亞基基因進行命名。

從AGPase發(fā)現(xiàn)至今，隨著編碼AGPase的基因的確定，命名也越趨豐富，根據(jù)不同的分類標(biāo)準(zhǔn)，有著不同的命名。

2 AGPase的理化性質(zhì)

2.1 AGPase的結(jié)構(gòu)

細(xì)菌AGPase是同源四聚體酶，由單基因編碼形成。與細(xì)菌不同，植物AGPase是由成對的兩個大、小亞基構(gòu)成的異源四聚體，分別由大小亞基對應(yīng)基因編碼形成［14］，因而在結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)上都表現(xiàn)出與細(xì)菌AGPase不同的性質(zhì)。

天然植物異源四聚體AGPase的結(jié)晶體的獲得存在諸多障礙，而細(xì)菌同源四聚體AGPase結(jié)晶體相對容易，這為進一步了解植物異源四聚體AGPase結(jié)構(gòu)特性提供了幫助。Cupp－Vickery等［15］采用硫酸鋰作為沉降劑分離純化得到農(nóng)桿菌AGPase結(jié)晶體，用x射線衍射結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌AGPase的結(jié)構(gòu)模型中含有兩個區(qū)域:N端類似三明治結(jié)構(gòu)域和C端β螺旋平行結(jié)構(gòu)域。而Tuncel等［16］就通過對單個AGPase大亞基三維結(jié)構(gòu)模型預(yù)測異源四聚體的結(jié)構(gòu)。通過分子動力學(xué)試驗?zāi)M所有可能結(jié)合的二聚體形式，再從動力學(xué)試驗數(shù)據(jù)分析得到最適的二聚體組合形式，連同位點突變及酵母雙雜交試驗，最終確定了AGPase最佳的四聚體模型是LS與SS按橫向和縱向交錯排列組成。先通過橫向LS－SS二聚體形成，再縱向形成二聚體，最后形成完整四聚體結(jié)構(gòu)。

早期Fuchs曾報道玉米AGPase亞基分子質(zhì)量為96 ku，構(gòu)成的四聚體質(zhì)量為 400 ku 左右［17］。而Plaxton等［18］研究發(fā)現(xiàn)則不同，通過對灌漿期種子提取AGPase，聚丙烯凝膠電泳顯示，天然狀況下玉米胚乳AGPase分子質(zhì)量為230 ku。Bhave等［19］研究證實AGPase由54 ku亞基組成，但AGPase中也有60 ku亞基的存在(Barton，unpublished)。在玉米突變體研究中，采用蛋白雜交，在Bt2突變株中缺少為55 ku的亞基，而 Sh2突變株中缺少為60 ku的亞基［12］?？梢源_定，玉米AGPase質(zhì)量為230 ku左右，其中小亞基分子質(zhì)量為55 ku左右，大亞基為60 ku左右。

玉米AGPase基因中，研究最多的是Sh2和Bt2。對Sh2和Bt2克隆分析，二者都編碼了AGPase蛋白，與細(xì)菌編碼AGPase基因有很高的同源性。Sh2基因cDNA長為1.95 kb，確定有一個開放閱讀框(ORF)，編碼542個氨基酸，大約60 ku［12］。Bt2基因有9個內(nèi)含子和10個外顯子，外顯子1全長153 bp，起始轉(zhuǎn)錄 TATA 框位于 34 bp 處［20］。Prioul等［10］在對編碼玉米葉片中AGPase基因研究發(fā)現(xiàn)，編碼玉米葉片小亞基的cDNA有一個含125個氨基酸的開放閱讀框，而在3端非編碼區(qū)有236個核苷酸殘基，編碼區(qū)和玉米胚乳中Bt2有很高同源性，但3端非編碼區(qū)同源性則很低?？梢?，編碼AGPase不同基因，在結(jié)構(gòu)上存在差異。

2.2 玉米淀粉合成中作用

Espada在發(fā)現(xiàn) ADP－glucose(ADP－Glc)焦磷酸化酶時指出，其是催化淀粉合成第一步反應(yīng)。Thai等［21］通過試驗提出玉米淀粉合成產(chǎn)生是通過如下反應(yīng)得到:ATP+α－glucose 1－P=ADP－glucose+PPi。后來相繼發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)中的葡萄糖從蔗糖分解后，再通過AGPase等一系列催化反應(yīng)后淀粉合成所利用［22］，在玉米胚乳中，運輸?shù)桨|(zhì)蔗糖先經(jīng)蔗糖合酶的分解，產(chǎn)生的果糖和UDPG分別由磷酸變位酶和UDPG焦磷酸化酶反應(yīng)形成AGPase的反應(yīng)底物α－glucose 1－P(G1P)，形成 ADP－glucose(ADPG)后，轉(zhuǎn)移到造粉體中，再進一步生成淀粉。

2.3 AGPase的催化特性

由于研究酶催化特性時需要對酶進行純化，而酶純化存在比較高的難度，很多因素造成酶純化后活性損失。William等［23］在對酶進行純化過程時，發(fā)現(xiàn)采用絲氨酸酶蛋白抑制劑和抑糜霉素可以降低AGPase酶降解，提高酶純化活性，方便進行酶催化特性檢測。Plaxton等［18］采用了William研究結(jié)果純化AGPase，對玉米AGPase催化特性進行研究，發(fā)現(xiàn)玉米AGPase最適pH 7.4左右，高于或低于該數(shù)值都會使酶活性降低。pH過高或過低還會使酶失活。ATP和P－1－Glc是其反應(yīng)底物，PGA和Pi是其變構(gòu)調(diào)控劑，PGA能促進AGPase酶活，為正調(diào)節(jié)劑;Pi遏制AGPase酶活性，為負(fù)調(diào)控劑［18］。Hannah 等［24］在進行熱穩(wěn)定學(xué)試驗時，發(fā)現(xiàn)玉米AGPase最適反應(yīng)溫度為37℃，溫度過低過高均會影響AGPase活性。

3 AGPase的活性調(diào)節(jié)

3.1 調(diào)控劑對AGPase活性調(diào)控

目前，關(guān)于變構(gòu)激活劑3－PGA和變構(gòu)遏制劑Pi的研究較多［25－27］。在植物葉片、土豆塊莖和番茄果實中研究結(jié)果都表明AGPase對3－PGA和Pi敏感，但是在谷物胚乳中，除水稻外，都表現(xiàn)出對二者不敏感［25］。說明AGPase存在多樣性，對不同變構(gòu)調(diào)控劑反應(yīng)不同。在對玉米胚乳AGPase動力學(xué)特征研究中發(fā)現(xiàn)，其調(diào)控模式同細(xì)菌AGPase的調(diào)控模式相似，而同大麥葉子中的 AGPase有明顯不同［26］。后來，Boehlein S等［27］對玉米胚乳AGPase催化動力學(xué)進行了細(xì)致研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)存在飽和3－PGA(剛好滲透細(xì)胞)時，對ATP和G－1－P結(jié)合在AGPase上有遏制作用，當(dāng)缺少3－PGA時，遏制作用明顯去除，當(dāng)3－PGA存在時，ADP－Glc同ATP是競爭遏制劑關(guān)系，但當(dāng)有少量Pi存在時，ADP－Glc能促進催化活性。

通過化學(xué)修飾和突變研究方法，確定了ATP、G－1－P、ADPG及AMP在大腸桿菌AGPase中作用位點［28－30］。對此，Boehlein 等［31］采用突變方法在玉米胚乳AGPase大亞基和小亞基中，將丙氨酸替代精氨酸突變，與突變型和野生型相比較，突變型對3－PGA結(jié)合的親和性降低，同時對激活劑F6P和G6P表現(xiàn)出不敏感，Pi結(jié)合作用也受到精氨酸突變影響，確定精氨酸為調(diào)控劑結(jié)合關(guān)鍵位點。同時，Morell等［32］研究菠菜葉片 AGPase時確定一個有活性的Lys殘基在小亞基440左右，Preiss等［33］據(jù)此在土豆小亞基Lys－441點突變，研究發(fā)現(xiàn)突變后AGPase對3－PGA 親和性降低。Gardiol等［34］指出:Lys－39對激活劑結(jié)合大腸桿菌 AGPase非常重要，而由于Lys－39在植物AGPase中則高度保守，類似功能還沒有被證明?？梢娫诓煌仓甑恼{(diào)控位點上可以參考，但是不同植株AGPase調(diào)控位點還存在不同，還得具體分析。

3.2 溫度對AGPase活性影響

與土豆塊莖中AGPase特性不同，玉米AGPase為熱不穩(wěn)定型［24］。土豆AGPase在體外溫度達60℃時，仍然穩(wěn)定存在，而玉米體外溫度升高到57℃，持續(xù)5 min，玉米胚乳AGPase活性降低96%［35］。溫度升高，直接導(dǎo)致了AGPase活性降低，籽粒淀粉含量減少，玉米產(chǎn)量降低。為此，Singletary等［36］體外培養(yǎng)玉米籽粒，在整個玉米發(fā)育過程中，通過對玉米種子質(zhì)量和各種酶活性檢測，對玉米胚乳AGPase進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)體外溫度升高時，AGPase活性降低，玉米種子質(zhì)量降低。Duke等［37］研究結(jié)果同樣得出AGPase對溫度很敏感。

研究人員將熱不穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性AGPase相比較發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)定性AGPase中N端有著特殊結(jié)構(gòu)域。將這個特殊結(jié)構(gòu)域插入重組到玉米胚乳AGPase中，在58℃處理時，增加了70多倍的半衰期，雖然Kcat翻倍，但 Km值和底物特性沒有受到影響［38］。Greene等［35］在大腸桿菌中表達 Sh2和Bt2，在42℃時，合成糖元，呈現(xiàn)出較低活性，當(dāng)誘變后，分離出了可以在這個溫度合成糖元的幾種突變體，對這種Sh2突變體測序確定，在333位置組氨酸向酪氨酸的突變可以增加玉米AGPase熱穩(wěn)定性。另外，Boehlein等［39］在對調(diào)控劑研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用ATP和ADP－Glc調(diào)控時可以增加酶的熱穩(wěn)定性，而G－1－P和PPi則不能。

可見，結(jié)構(gòu)上的不同，決定了熱穩(wěn)定性的高低。但增加熱穩(wěn)定性的機理還不清楚，Boehlein等［39］認(rèn)為能增加AGPase亞基相互作用，就能提高AGPase的熱穩(wěn)定性，具體機理還有待繼續(xù)研究。

3.3 AGPase亞基間相互作用對酶活影響

玉米胚乳有活性的AGPase需要大小亞基共同作用，在把大小亞基單獨在大腸桿菌中表達時，僅表現(xiàn)出非常低的 AGPase 酶活性［40－41］。Greene 等［42］在玉米胚乳AGPase研究中，通過原核表達AGPase形成的單體和復(fù)合體，將產(chǎn)物酶活比較，發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)大小亞基結(jié)合時才能組成一個正常的有催化活性的酶，而在缺失大亞基情況下表達小亞基時，小亞基只能形成有酶活性很低的同源四聚體AGPase。有研究發(fā)現(xiàn)，小亞基形成的同源四聚體不能夠發(fā)生變構(gòu)效應(yīng)［43］。同時，單獨表達大亞基時，則不能有效形成同源四聚體，沒有具有催化活性的AGPase功能［43－45］。

Hwang等［46］提出變構(gòu)調(diào)節(jié)是大小亞基之間協(xié)作的結(jié)果。在隨后研究中，其對AGPase大亞基ATP結(jié)合區(qū)域進行突變后，發(fā)現(xiàn)其不僅影響對底物親和性，而且影響很多催化特性，如對3PGA的敏感度，指出雖然大亞基不參與催化，但是其與小亞基共同完成了底物結(jié)合及催化效應(yīng)［47］。深入研究表明當(dāng)大亞基與小亞基結(jié)合時，其也具有催化和調(diào)控作用，異源四聚體就是大小亞基協(xié)同作用的結(jié)果［48］。

4 AGPase基因表達規(guī)律及其進化關(guān)系

植物編碼AGP－L和AGP－S亞基有多種基因，并且在不同的組織器官中有不同的表達。Prioul等［10］通過將胚乳中Bt2和Sh2的mRNA作為探針，與葉片中的AGPase基因表達的mRNA雜交，發(fā)現(xiàn)了和Bt2有信號，其將葉片中的L2克隆與Bt2比較發(fā)現(xiàn)，在編碼區(qū)有97%的同源性，而將Sh2mRNA探針雜交卻沒有信號。而在編碼AGPase小亞基的基因中，有一類基因同時編碼兩個小亞基蛋白。該編碼兩個小亞基的基因從一個編碼單個亞基的基因進化而來，通過選擇不同的外顯子，編碼不同的小亞基。除了在玉米中沒有報道外，在其他單子葉植物中均有報道這類基因存在［45］。在玉米中，Bt2和L2被認(rèn)為是像其他單子葉植物中的那類基因一樣。但是Rosti等［49］研究表明，Bt2和L2是平行基因，產(chǎn)生原因是由于玉米基因組的四倍性。兩個基因從共同的祖先通過剪切形成同源基因而來。通過不斷的復(fù)制，Bt2和L2在功能上發(fā)生的偏離。使得一個在胚乳中表達，而另一個在葉片中表達。這都說明了編碼AGPase亞基基因多樣性，在葉片和胚乳中編碼AGPase基因不同。

有研究認(rèn)為玉米胚乳中AGPase是質(zhì)體型。從玉米胚乳原生質(zhì)體中分離出來的質(zhì)體存在著AGPase酶活性。另外，免疫印記在質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)了標(biāo)記，說明了 AGPase 在質(zhì)體中的存在［50］。但 Denyer等［51］在玉米胚乳研究結(jié)果表明，AGPase酶活性主要存在于胞質(zhì)中，其將提取的胞質(zhì)和質(zhì)粒AGPase比較，酶活分析胚乳表明，大約85%的酶活性是在細(xì)胞質(zhì)粒外。這說明，AGPase主要活性主要在胞質(zhì)中分布，而在胞質(zhì)和質(zhì)粒中可能存在不同的亞基構(gòu)成 AGPase。Tetlow等［52］也進行了亞細(xì)胞定位，其通過對亞細(xì)胞的標(biāo)識酶活性高低先對提取效果進行評價，再通過免疫印記對AGPase進行確定，其試驗指出，AGPase大亞基是細(xì)胞中主要的提取物，而小亞基則不如大亞基豐富，但是其在質(zhì)體中確有大量表達。這個結(jié)果同在其他植株中發(fā)現(xiàn)的一樣，這些說明了在在質(zhì)體中和胞質(zhì)中存在不同的AGPase亞基［52］。AGPase基因在各組織的表達規(guī)律不同，機理還有待進一步研究。

從進化上看，雖然AGPase基因來自同一個祖先［12，14］，但是編碼 AGPase大小亞基之間同樣存在著進化差異。Smith等［53］把編碼兩個亞基的核苷酸序列進行比較時，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在差異，和與大亞基不同，小亞基有著更為保守的核苷酸順序?，F(xiàn)在高通量熒光技術(shù)使我們能夠更加了解蛋白質(zhì)相互作用。通過蛋白質(zhì)的相互作用來看進化關(guān)系，F(xiàn)raser等［54］對此進行研究，指出相互作用蛋白按同樣速度進化，一個蛋白的置換必然導(dǎo)致其對相互作用蛋白的選擇壓力。蛋白擁有相互作用蛋白越多其進化速度就慢些，主要是因為這個蛋白停留在他的不變的功能造成。

5 在育種中的應(yīng)用

GPase在谷物種子淀粉積累上起著重要作用，對作物產(chǎn)量有重要影響。早期在細(xì)菌AGPase突變體中，發(fā)現(xiàn)的glgC16突變菌株，其有較高的AGPase活性及對變構(gòu)抑制劑反應(yīng)遲緩特性。Stark等［7］將其轉(zhuǎn)到馬鈴薯中，發(fā)現(xiàn)增加了35%的淀粉產(chǎn)量。同樣Wang等［5］將其與胚乳組織特異啟動子構(gòu)成載體，轉(zhuǎn)入到玉米中表達，發(fā)現(xiàn)種子質(zhì)量增加了22%～25%，發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)基因的種子對無機遏制劑Pi不敏感。另外，又發(fā)現(xiàn)的一種大腸桿菌突變體，將其轉(zhuǎn)進水稻，在水稻中表達，也發(fā)現(xiàn)增加了水稻產(chǎn)量11%［55］。

由于很多試驗證明谷物種子產(chǎn)量降低是由于溫度升高使AGPase活性降低，為了更加了解這個問題，Greene等［56］由大腸桿菌表達系統(tǒng)分離出一個玉米胚乳熱穩(wěn)定的AGPase大亞基。用這個突變體轉(zhuǎn)入作物中，使小麥增產(chǎn) 38%，水稻 23%，玉米68%［57－58］。最近，Georgelis 等［59］從玉米胚乳 AGPase中，通過細(xì)菌表達系統(tǒng)，篩選出一個在462位的蘇氨酸向異亮氨酸突變體，命名為突變BT2－TI，該突變體與野生型玉米AGPase相比較，呈現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性。將其導(dǎo)入到另一個含有玉米胚乳和馬鈴薯塊莖的熱穩(wěn)定性AGPase嵌合體(MP)中，呈現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性，當(dāng)其在單子葉植物中表達時，可以提高作物產(chǎn)量。

將AGPase位點修飾后，應(yīng)用在作物生產(chǎn)上，也有明顯的效果。Greene等［60］早期對AGPase調(diào)控位點進行研究，其發(fā)現(xiàn)改變調(diào)控位點可以增加AGPase活性。Obana等［61］在Greene的研究基礎(chǔ)上，將土豆塊莖中AGPase對應(yīng)調(diào)控位點修飾后的，轉(zhuǎn)移在擬南芥葉片中表達，與野生型植株相比較，該突變酶對激活劑更加敏感，對遏制劑不那么敏感。這增加了葉片AGPase活性和轉(zhuǎn)移淀粉的積累，提高作物產(chǎn)量，同樣也增加了生長性狀。而在Boehlein等［62］的研究中，其將土豆塊莖和玉米胚乳AGPase重組得到嵌合AGPase，發(fā)現(xiàn):當(dāng)其表達在植物中時表現(xiàn)出了更加優(yōu)越的性質(zhì)。

隨著對AGPase研究的深入，篩選出了更有特性的AGPase突變株。超甜玉米的利用就是建立在sh2突變體的成功選育。與建立在su1突變所產(chǎn)生的一般甜玉米不同，sh2突變使得玉米胚乳中AGPase酶活明顯降低，導(dǎo)致淀粉合成上游通路中斷，使玉米胚乳糖含量比一般甜玉米糖含量高出2～4倍［63］。

6 問題及展望

在Sh2突變和Bt2突變株胚乳研究中，雖然大部分AGPase酶活性由于突變而使活性喪失，但是在胚乳中仍然存在殘留AGPase酶活性［2］。是否是質(zhì)體中產(chǎn)生的AGPase經(jīng)轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)中，造成有殘留AGPase活性存在，Villand等［64］分析cDNA玉米胚乳AGPase小亞基和小麥胚乳AGPase小亞基表明其不存在轉(zhuǎn)移信號肽編碼序列，說明殘留AGPase酶活不是由于轉(zhuǎn)運引起。有學(xué)者猜想，活性殘留是否是由于Sh2或Bt2基因突變后，編碼的Sh2或Bt2蛋白形成同源四聚體而導(dǎo)致有殘余活性存在，但是研究結(jié)果表明殘余活性存在不是由于Sh2或Bt2形成同源四聚體，證明剩余AGPase酶活性產(chǎn)生不是由于Sh2 和 Bt2 編碼蛋白產(chǎn)生［42］。對此，Hannah 等［65］提出疑問，Sh2和Bt2突變是否只導(dǎo)致了編碼AGPase酶結(jié)構(gòu)的改變而非缺失，這可能是存在殘留酶活的原因。至于在不同位置AGPase真實形式還有待進一步了解。

AGPase酶活性調(diào)節(jié)研究中，無機調(diào)控劑作用位點對AGPase變構(gòu)效應(yīng)影響一直就是酶活調(diào)控研究熱點。然而，近年來對AGPase酶活性調(diào)控研究有了更多的了解。Tiessen等［66］在土豆中對AGPase研究發(fā)現(xiàn)，增加DTT可以促進AGPase活性，同時發(fā)現(xiàn)AGPase活性受光調(diào)控影響，指出葉片中AGPase活性變化是否通過光信號途徑產(chǎn)生氧化勢來影響了AGPase酶活性。還原劑硫氧還蛋白還原酶C(NTRC)通常被認(rèn)為是在黑暗條件下還原過氧化氫，至于它是否還有其他功能并不清楚。Michalska等［67］通過在光照處理及外施蔗糖情況下，施加NADPH，結(jié)果分析表明了NTRC在光和蔗糖存在下對AGPase的調(diào)控作用，參與了對AGPase的氧化調(diào)控作用。同樣，Oliver等［68］發(fā)現(xiàn)降低腺苷酸激酶表達量，可以增加淀粉的積累，為此進行了深入研究，證明了腺苷酸參與AGPase氧化還原調(diào)控。相信在將來AGPase的氧化還原調(diào)控將是一個研究重點。

在熱穩(wěn)定性調(diào)節(jié)中，Boehlein［39］將 AGPase進行熱處理過程中，發(fā)現(xiàn)存在兩種不同催化特性的AGPase。對于玉米AGPase熱穩(wěn)定性出現(xiàn)的這種雙重性，Boehlein提出三種解釋:第一，在玉米胚乳中，一直就存在兩種形式的AGPase，主要形式F1，很易被降解，而少量的F2則降解很慢，出現(xiàn)鈍化。當(dāng)熱處理時，大量的F1降解，使得酶活性很快降低。有少量的F2降解，因而后續(xù)降解速度則很慢。第二，在熱處理之前，只存在一種AGPase形式，即熱不穩(wěn)定型，當(dāng)熱處理后，熱不穩(wěn)定型轉(zhuǎn)化為活性較低的熱穩(wěn)定型。兩者之間轉(zhuǎn)化速度很慢，因而能觀察AGPase兩重性活性存在。第三，只存在一種AGPase形式，在熱處理后，部分分子降解，而其他分子則慢慢轉(zhuǎn)化為活性穩(wěn)定的AGPase形式。假說成立與否，有待進一步研究。

通過改變AGPase酶變構(gòu)調(diào)節(jié)位點，提高AGPase酶活及穩(wěn)定性可以增加作物淀粉的合成。Boehlein等［39］在調(diào)控劑研究上，發(fā)現(xiàn)變構(gòu)調(diào)節(jié)與熱穩(wěn)定性之間有重要關(guān)系，經(jīng)典調(diào)控劑3－PGA和Pi，除了作為AGPase變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，其同樣影響著AGPase的熱穩(wěn)定性。Pi，最為典型的AGPase遏制劑之一，在熱力學(xué)試驗中，其在沒有其他代謝調(diào)控因子，與酶結(jié)合，而不遏制酶活性。同樣在沒有其他激活因子存在情況下，其替代結(jié)合因子使酶回復(fù)活性。ATP和ADPGlc可以保護AGPase，防止熱滅活，而3－PGA作用是協(xié)助其防止熱滅活，至于變構(gòu)調(diào)節(jié)劑是如何影響熱穩(wěn)定性，還有待進一步研究。同樣，在研究AGPase亞基與亞基之間相互作用時，仍然有了解的真空帶，由于天然的異四聚體的晶體結(jié)構(gòu)的未知，使得在研究AGPase的獨立亞基如何通過相互作用而形成了有活性的四聚體變得困難。

在研究AGPase進化上，由于通過序列比對發(fā)現(xiàn)小亞基比大亞基更保守，因而具有更高的進化速度。但是從突變研究看出，當(dāng)在相同的細(xì)胞環(huán)境下，就酶活考慮，AGPase大小亞基對于無義突變有著相同的耐受力。在對AGPase隨機突變條件下，大小亞基有著相同的突變率影響AGPase活性。Georgelis等［59］在AGPase進化速度上，對大亞基進化速度高于小亞基觀點提出了不同意見，指出要是考慮到有多種大亞基及不同的環(huán)境條件下，則應(yīng)該對小亞基造成更大的選擇壓力，小亞基應(yīng)該有更高的進化速度。對不同觀點還有待進一步研究。

隨著玉米全基因組測序的完成，其他各學(xué)科的發(fā)展，特別是生物信息學(xué)的發(fā)展，加上一些新的實驗技術(shù)的應(yīng)用，在以后對AGPase研究必將上升到一個新的臺階。利用生物信息學(xué)，對多亞基AGPase作用位點預(yù)測，通過新實驗技術(shù)，對AGPase空間結(jié)構(gòu)及具體相互作用位點進行深入了解，將目前突變來研究AGPase主要功能位點與其他學(xué)科的聯(lián)合，共同研究功能位點，將有事半功倍的效果。在代謝路徑調(diào)控上，影響AGPase差異表達及組織特異性原因還不清楚，通過分子生物學(xué)手段，對AGPase基因調(diào)控原件進行分析，最終了解認(rèn)識調(diào)控代謝的原因。此外，還要加深A(yù)GPse酶在整個淀粉合成代謝途徑中的作用地位，整體研究淀粉合成。這樣對深入了解玉米淀粉合成機理，實現(xiàn)淀粉合成的人工調(diào)控有重要意義。

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Study Progress of Maize ADP－Glc pyrophosphorylase

Chen Jiang1Liu Hanmei2Huang Yubi1，3
(Maize Research Institute，Sichuan Agricultural University1，Ya'an 625014)
(College Of Life Science，Sichuan Agricultural University2，Ya'an 625014)
(Key Laboratory of Southwest Crop Genetic Resources and Improvement Ministry of Education3，Ya'an 625014)

Maize starch is the main source of starch for humans，animals eating and the industrial use.The synthesis of which is orchestrated by four major enzymes，ADP－glucose pyrophosphorylase(AGPase)，starch synthase(SS)，starch－branching enzyme(SBE)and de－branchingenzyme(DBE).ADP－glucose pyrophosphorylase(AGPase)，catalyzing the rate－limiting step in starch biosynthesis in plants，play an important role in the synthesis process of starch.Through deeply studying to AGPase，we can reveal the mechanism of starch biosynthesis，by which we can control the starch synthesis by ourselves.This article aimed at a summary for maize AGPase's physicochemical property，regulation of enzyme activity，expression rules and the application of the breeding.Also this paper put forward opinions on the problems and predicted the future research of AGPase.

Maize，Starch biosyntheses，ADP － Glc pyrophosphorylase，Biosynthese characteristics

S513

A

1003－0174(2012)04－0114－09

國家自然科學(xué)基金(C1302)

2010－10－12

陳江，男，1986年出生，碩士，玉米淀粉合成

黃玉碧，男，1963年出生，教授，博士生導(dǎo)師，作物遺傳育種