趙遼群

陜西省延安市婦幼保健院檢驗(yàn)科，陜西 延安 716000

乙肝兩對(duì)半又稱乙肝五項(xiàng)，為國(guó)內(nèi)常用的乙肝病毒（HBV）感染的檢測(cè)血清標(biāo)志物。乙肝病毒免疫學(xué)標(biāo)記有表面抗原（HBsAg）和表面抗體（抗 HBs或 HBsAb）、e 抗原（HBeAg）和e抗體（抗HBe或HBeAb）、核心抗原（HBcAg）和核心抗體（抗HBc或HBcAb）[1]，可檢測(cè)患者是否感染乙肝及感染的具體情況。隨著現(xiàn)代臨床免疫學(xué)的發(fā)展，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）因其操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性高等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于乙肝五項(xiàng)的檢測(cè)[2]。但由于乙肝標(biāo)志物檢測(cè)生產(chǎn)試劑廠家較多，各種試劑診斷靈敏度及特異性相差很大。因此如何選擇靈敏度高、特異性好的乙肝標(biāo)志物檢測(cè)試劑成為乙肝檢測(cè)中至關(guān)重要的問(wèn)題之一。本研究分別選擇3家國(guó)產(chǎn)ELISA試劑盒對(duì)來(lái)我院參加健康體檢患者血液樣品進(jìn)行乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2005年6月～2010年11月健康體檢患者220例，其中，男140例，女80例；年齡23～50歲，平均38.5歲。抽取患者靜脈血，分離血清，低溫（15℃）保存待檢。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)試劑 檢測(cè)試劑盒分別購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司（簡(jiǎn)稱江萊），北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司（簡(jiǎn)稱萬(wàn)泰）、英科新創(chuàng)（廈門(mén)）科技有限公司（簡(jiǎn)稱新創(chuàng)）。其中包括96孔（48人份）酶標(biāo)板，陰性對(duì)照1 mL，陽(yáng)性對(duì)照1 mL，酶結(jié)合物6 mL，顯色劑A 6 mL，顯色劑B 6 mL，20倍洗滌液40 mL，終止液6 mL，說(shuō)明書(shū)1份，不干膠3張，自封袋1個(gè)?？笻BV金標(biāo)試紙條購(gòu)自新創(chuàng)。

1.2.2 檢測(cè)儀器 振蕩器（型號(hào)ZD-8800），磁力攪拌器（型號(hào)JB90-D）均購(gòu)自上海精密儀器儀表有限公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自鄭州安圖生物工程有限公司，型號(hào)：Anthos2010。

1.2.3 檢測(cè)方法 采用ELISA法檢測(cè)。嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行，即：①使用前，充分混勻所有試劑，勿產(chǎn)生泡沫。②根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量確定所需酶標(biāo)板數(shù)量。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照孔1孔，陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各2孔。待檢標(biāo)本用稀釋液1∶1稀釋后加入50 μL于酶標(biāo)板反應(yīng)孔內(nèi)。采用棋盤(pán)法做倍比稀釋，使標(biāo)本濃度依次為 40、20、10、5.0、2.5、1.25、0 IU/L。 同樣方法稀釋陰性血清。③加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品及陰性血清50 μL于反應(yīng)孔，待測(cè)樣品50 μL于反應(yīng)孔內(nèi)，立即加入50 μL的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃孵育1 h。④甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作5次。⑤每孔加入80 μL的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃孵育30 min。⑥重復(fù)步驟④1次。⑦每孔加入底物A、B各50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10 min。避免光照。⑧取出酶標(biāo)板，迅速加入50 μL終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。⑨在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。分別用3個(gè)不同公司的試劑盒進(jìn)行初測(cè)，初測(cè)ELISA陽(yáng)性標(biāo)本再采用膠體金法測(cè)定1次。金標(biāo)試紙條于檢測(cè)線及對(duì)照線位置處各出現(xiàn)一條紫紅色線條為陽(yáng)性，只于對(duì)照線位置出現(xiàn)1條紫紅色線條為陰性，未出現(xiàn)任何線條表示金標(biāo)試紙條失效。

1.3 結(jié)果判定及觀察項(xiàng)目

測(cè)定孔OD值/陰性對(duì)照孔OD值（S/N）大于2.1判為陽(yáng)性。比較3個(gè)不同公司ELISA檢測(cè)靈敏度、特異性及與膠體金法檢測(cè)的一致性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

江萊、萬(wàn)泰、新創(chuàng)三家廠家生產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)HBsAg陽(yáng)性率分別為 12.3%（27/220）、9.5%（21/220）、13.6%（30/220）。 新創(chuàng)陽(yáng)性率最高。陽(yáng)性血清經(jīng)金標(biāo)試紙條檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果分別為24、18、27例。新創(chuàng)試劑盒ELISA法檢測(cè)抗原包被濃度為1.25 IU/L時(shí)，仍可檢出陽(yáng)性標(biāo)本。其他兩個(gè)試劑盒最低檢出濃度為 2.5 IU/L，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.25，P ＞ 0.05）。

3 討論

慢性乙型肝炎為世界性醫(yī)學(xué)難題之一，為世界范圍內(nèi)引起慢性肝臟疾病的主要病原之一，起病緩慢，感染率高，我國(guó)為HBV感染的主要流行病區(qū)，截至2011年有慢性HBV攜帶者約1.2億，慢性乙型肝炎患者約3 000萬(wàn)例，以每年新增病例10萬(wàn)～25萬(wàn)的速度增長(zhǎng)。大多數(shù)患者無(wú)明顯癥狀，并可導(dǎo)致肝硬化、肝癌等終末期肝病，目前尚無(wú)治療特效藥。主要通過(guò)血液、母嬰及性接觸傳播。乙肝疫苗為控制及預(yù)防乙型肝炎的主要措施。HBsAg血清中HBsAg陽(yáng)性是HBV感染的標(biāo)志。本身有抗原性，無(wú)傳染性。但由于HBsAg常與HBV同時(shí)存在，通常認(rèn)為是傳染性標(biāo)志之一。HBV標(biāo)志物檢測(cè)是臨床診斷乙肝感染的重要依據(jù)，也是抗病毒治療檢測(cè)的重要指標(biāo)之一。臨床通常采用免疫學(xué)檢測(cè)及核算檢測(cè)兩類方法進(jìn)行?；诿庖邔W(xué)檢測(cè)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)因操作方便、靈敏度高、特異性好而較多用于乙肝患者的初篩。

膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑作用下，聚合成一定大小的金顆粒，由于靜電作用形成一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，在弱堿性環(huán)境下可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固結(jié)合，這種結(jié)合為靜電結(jié)合，不影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)[3]。單克隆抗體包被于檢測(cè)線處，抗金標(biāo)抗體包被于對(duì)照線處，金標(biāo)抗體吸附于固相載體無(wú)紡紗上。利用抗原抗體特異性結(jié)合的免疫反應(yīng)原理，在檢測(cè)線處形成抗體-待測(cè)抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物，在對(duì)照線處形成抗金標(biāo)抗體-金標(biāo)抗體復(fù)合物。具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、使用方便等優(yōu)點(diǎn)。但常因判斷結(jié)果時(shí)間不夠、反應(yīng)不充分、溫度低、樣本加樣問(wèn)題、過(guò)濾膜破損等原因?qū)е屡袛嗍д`，也可因臨床醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)不足把隱約可見(jiàn)的陽(yáng)性線誤判為陰性等不正常結(jié)果發(fā)生。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)HBV抗體為較簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)方法。臨床檢測(cè)通常檢測(cè)HBsAg及HBsAb[4]。HBsAg為病毒外膜蛋白的重要組成成分，為HBV感染的最主要的血清學(xué)檢測(cè)指標(biāo)。HBsAg陽(yáng)性提示HBV現(xiàn)癥感染，陽(yáng)性持續(xù)時(shí)間超過(guò)6個(gè)月則為慢性HBV感染。目前國(guó)內(nèi)HBsAg檢測(cè)使用的ELISA法多為定性檢測(cè)，只能初步判斷陰性或者陽(yáng)性，也有半定量檢測(cè)的ELISA試劑盒，通常以信號(hào)/臨界值（singal/cut-off，S/CO）或臨界指數(shù)表示。ELISA試劑盒評(píng)價(jià)指標(biāo)為檢測(cè)靈敏度及檢測(cè)廣譜性[5]。目前國(guó)產(chǎn)HBsAg ELISA試劑盒靈敏度在 0.2～0.5 U/mL之間。HBV 9種不同血清型 ayw1、ayw2、zyw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq+、adwq-，分別位于 HB-sAg第2、3跨膜區(qū)親水區(qū)的a表位為各血清型病毒共有的免疫優(yōu)勢(shì)表位。正是由于不同血清型a表位氨基酸組成的差異，導(dǎo)致同一試劑對(duì)不同血清型病毒檢測(cè)能力存在差異。本組研究中新創(chuàng)公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒靈敏度略高于其他兩個(gè)公司，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。不同廠家生產(chǎn)的ELISA試劑盒檢測(cè)HBsAg結(jié)果存在不一致性，可能與廠家用于檢測(cè)時(shí)包被的乙肝病毒基因片段不一致有關(guān)。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同廠家ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果存在差異，臨床檢測(cè)時(shí)需綜合幾個(gè)試劑盒結(jié)果及其他試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

[1]顧志冬，吳倩文，馮曉靜，等.用于國(guó)產(chǎn)一步法HBsAg ELISA試劑及確認(rèn)試驗(yàn)試劑的改進(jìn)方法[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2011，26（1）：32-35.

[2]陳慧英.對(duì)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)肝炎病毒血清標(biāo)志物臨界結(jié)果報(bào)告的探討[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2006，21（Z1）：54-56.

[3]祝繼華，嚴(yán)立，陳瀑，等.ELISA法在檢測(cè)乙肝標(biāo)志物中的應(yīng)用和評(píng)價(jià)[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，34（10）：1397-1399.

[4]孫寶春，付春祥.三種不同廠家試劑檢測(cè)血清HBsAg、HBsAb結(jié)果比較[J].山東醫(yī)藥，2010，50（27）：89.

[5]李蘭娟.努力提高我國(guó)病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室診斷水平[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，30（8）：845-849.