羅成宏，崔玉真，朱東銘，朱永瑤，付倫姣，楊 媚，蘇斌儒，陳月富，陸偉恒，許鵬杰，肖 波

甲狀腺功能亢進(jìn)性周期性麻痹(Thyrotoxic Hypokalemic Periodic Paralysis，THPP)是以突發(fā)、復(fù)發(fā)及可逆發(fā)作的肌肉無(wú)力為特征的一種疾病，作為甲狀腺功能亢進(jìn)的并發(fā)癥，THPP在西方國(guó)家很少發(fā)生，但在亞洲男性中，發(fā)病率可達(dá)10%［1］。至今為止，THPP中男性占優(yōu)勢(shì)以及種族差異的原因仍然令人費(fèi)解。GABRA3基因?yàn)榫幋aGABA受體α3亞單位的基因，是氯通道蛋白家族的一員，該基因高度表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)肌肉接頭處，且另有研究表明GABRA3表達(dá)于骨骼肌的多個(gè)位點(diǎn)，其基因突變有可能影響了神經(jīng)肌肉接頭處遞質(zhì)的傳遞，從而導(dǎo)致乏力的發(fā)生。有趣的是GABRA3基因位于X染色體上，該基因與THPP的男性優(yōu)勢(shì)發(fā)病有無(wú)內(nèi)在聯(lián)系，值得我們進(jìn)一步探討。本研究選取GABRA3基因3號(hào)內(nèi)含子rs12688628(G/T)多態(tài)性與中國(guó)南方男性甲亢性周期性麻痹的的相關(guān)性進(jìn)行了探討。

1 資料與方法

1．1 研究對(duì)象 本研究選取本院神經(jīng)內(nèi)科、內(nèi)分泌門診及住院男性患者，根據(jù)典型臨床表現(xiàn)，甲狀腺功能測(cè)定結(jié)果及血鉀測(cè)定結(jié)果，分成THPP組(35例)、GD組(35例)，HPP組(25例)，其中包括腎小管酸中毒3例，原發(fā)性醛固酮增多癥4例，嗜鉻細(xì)胞瘤3例，家族性低鉀周期性麻痹2例，原因不明低鉀周期性麻痹13例，以及另選健康人群組成NC組(35例)。THPP組患者，年齡17～56歲，平均29．81±10．26歲，診斷標(biāo)準(zhǔn):(1)甲亢的臨床表現(xiàn)及甲狀腺功能檢測(cè)TSH↓，F(xiàn)T4、FT3↑;(2)急性肌無(wú)力(不能行走);(3)發(fā)作時(shí)血 K+＜3．5mmol/L;(4)排除其他導(dǎo)致低鉀血癥疾病所致的低鉀性麻痹。HPP組患者，年齡21～62歲，平均 31．15±12．26歲，診斷標(biāo)準(zhǔn):(1)急性肌無(wú)力(不能行走);(2)發(fā)作時(shí)血K+＜3．5mmol/L;(3)排除利尿劑、瀉藥、激素等藥物以及甲狀腺功能亢進(jìn)導(dǎo)致的低鉀周期性麻痹。GD組患者，年齡 20～60歲，平均 30．27±11．74歲，Graves’病診斷標(biāo)準(zhǔn):(1)甲狀腺功能亢進(jìn)診斷成立;(2)甲狀腺腫大成彌漫性;(3)無(wú)低鉀性麻痹的臨床表現(xiàn)，血鉀在正常范圍(3．5～5．5mol/L)，無(wú)低鉀及癱瘓發(fā)生。NC組，年齡19～53歲，平均27．19±10．43歲，主要來(lái)源于本院職工、學(xué)生及體檢中心相匹配的健康人群。常規(guī)體檢TSH、FT4正常(0．27＜TSH ＜4．2mU/L，12．0 ＜FT4 ＜22pmol/L)，并且排除高血壓病、心、肝、肺、腎腫瘤等疾病，無(wú)甲狀腺功能亢進(jìn)或低鉀周期性麻痹家族史。入選對(duì)象均為來(lái)自廣東、廣西、江西、湖南、四川、福建等省無(wú)血緣關(guān)系的漢族人群，4組患者年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 DNA 的提取 EDTA抗凝全血5ml，置于－80℃冰箱保存，后集中標(biāo)本使用BloodZol試劑盒提取DNA。

1．2．2 GABRA3基因多態(tài)性分析 使用巢式PCR擴(kuò)增包含rs12688628片段。一次PCR(目的片段)，引物序列為 F:5’TTTCTATGAGGCTGGCTAT 3’;R:5’TAAACAGGTTGCTTACGG 3’。DNA 樣本經(jīng) HhaI(Promega，HhaI，10U，10g/L 牛血清蛋白0．2μl，10 ×緩沖液2μl，DNA 樣品 10μl，加去離子水至總體積20μl)37℃消化3h后;65℃孵育 20min以終止反應(yīng);然后在 PT-200型熱循環(huán)儀上進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增．反應(yīng)體系為 50μl，含10mmo l/L dNTP(GibcoBRL)4μl，10 × 緩沖液 5 μl，50mmo l/LMgC l 1．5μl，Taq DNA 聚 合酶(G ibcoBRL)1．25U，20pmol/L引物 1 μl，DNA 樣 品 5 μl．。95℃ 5 m in預(yù)變性后，95℃變性30s，58℃淬火 2 0s，72℃ 延長(zhǎng) 1 min，共 1 5個(gè)循環(huán)，72℃延長(zhǎng) 10min;二次 PCR(目的片段140bp)，引物序列:F:5’AGTGATGGCACAAGAATCAGTCCTT 3’;R:5’CAGATGTTTCATTCTTAATG 3’。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物配成酶切反應(yīng)體系，其中 P CR 產(chǎn) 物10μl、緩沖液2μl、內(nèi)切酶 3 U，加 d dH2O至20μl體系，37℃酶切4h，65℃ 10min 終止酶切反應(yīng)，內(nèi)切酶為EcoNI(NEB R0521L)，25g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察電泳圖譜進(jìn)行基因分型。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件和遺傳學(xué)數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)及方差分析?；蛐驮诎l(fā)病危險(xiǎn)性中的比較均使用χ2檢驗(yàn)/Fisher確切概率法檢驗(yàn)。比值比(odds radio，OR)估計(jì)等位基因型對(duì) THPP發(fā)病的相對(duì)危險(xiǎn)性，按 Hardy-Weiberg平衡法檢測(cè)樣本的群體代表性。P≤0．05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 GABRA3基因DNA提取結(jié)果及巢式PCR擴(kuò)增目的片段 見(jiàn)圖1。

圖1 GABRA3基因DNA提取結(jié)果及巢式PCR擴(kuò)增目的片段圖

表1 THPP組、HPP組、DG組及NC組患者一般情況分析表

表2 THPP組與其他對(duì)照組在rs12688628位點(diǎn)的基因型比較

2．2 基因擴(kuò)增酶切產(chǎn)物結(jié)果 本研究研究對(duì)象為男性，GABRA3基因位于X染色體上，因此每個(gè)個(gè)體均只有1個(gè)等位基因，基因型分為兩型。rs12688628 PCR產(chǎn)物酶切后呈2種等位基因型。突變不被酶切(保持140bp)，為T基因型，沒(méi)有突變被酶切成113bp及27bp兩條帶，為 G型，因27bp太小，瓊脂糖電泳無(wú)法檢測(cè)到，故以上基因型的條帶相應(yīng)減少1條。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)GABRS基因內(nèi)含子rs12688628擴(kuò)增酶切產(chǎn)物圖

2．3 各組患者臨床特征 如表1所見(jiàn)。4組患者年齡組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。發(fā)作時(shí)，THPP組與HPP組血鉀水平均明顯低于正常水平(3．5mmol/L)，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；A(chǔ)狀態(tài)下(THPP組與HPP組為補(bǔ)鉀后或未發(fā)作時(shí))，THPP組、HPP組與GD組兩組間比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;THPP組的TSH與HPP組、NC組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0．05)，GD組與HPP組、NC組比較也是降低的，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0．05)，其他兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;THPP組FT4與其他3組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0．05)。GD組與HPP組、NC組比較同樣是升高的，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0．05)。其他兩兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;THPP組FT3與HPP組比較是升高的，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，GD組與HPP組比較也是升高的，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，而其他兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2．4 4組患者等位基因頻率比較 按Hardy-Weinberg平衡定律對(duì)研究總?cè)巳夯蝾l率進(jìn)行平衡檢驗(yàn) χ2=3．62，df=1，P ＞ 0．05，同時(shí)對(duì) THPP 組、HPP組、DG組及NC組進(jìn)行平衡檢驗(yàn)顯示，THPP組χ2=0．75，df=1，P ＞0．25;HPP 組 χ2=0．64，df=1，P＞0．5，DG 組 χ2=0．74，df=1，P ＞0．25，NC 組 χ2=0．44，df=1，P ＞0．5，均符合 Hardy-Weinberg 平衡。由表2可見(jiàn)rs12688628位點(diǎn)THPP組G等位基因頻率均高于其他組，與DG組、NC組有顯著差異，但與HPP組無(wú)顯著差異，rs12688628位點(diǎn)G等位基因攜帶者相對(duì)GD組患THPP的危險(xiǎn)性顯著增高(OR=15．13)，相對(duì) NC組患病危險(xiǎn)性也增高(OR=5．56)。

3 討論

近年來(lái)基因多態(tài)性與THPP的相關(guān)性研究主要集中在3個(gè)通道蛋白基因:CACNA1S、SCN4A、KCNE3，分別為編碼骨骼肌Ca2+通道、Na+通道和K+通道的基因。編碼CACNA1S的基因被確認(rèn)為是家族性低鉀性周期性麻痹(Family hypokalemic Periodic Paralysis，F(xiàn)HPP)的致病基因，其具有3個(gè)錯(cuò)義突變R528H、R1239H、R1239G［2］，但是在 THPP 的研究中未發(fā)現(xiàn)這3個(gè)位點(diǎn)的突變［3，4］。研究者們?cè)谶M(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)THPP患者CACNA1S基因11號(hào)外顯子具有基因多態(tài)性，Kung AW等［5］在研究中國(guó)香港地區(qū)人群97例THPP患者CACNAIS基因11號(hào)外顯子的多態(tài)性時(shí)，發(fā)現(xiàn)了1491AAC/AAT、1551GGT/GGC、1564CGT/TTG。1551T→C的等位基因C頻率分別為 17%(THPP)、19%(GD)和 44%(NC)，1564C→T的等位基因T頻率分別為2%(THPP)、3%(GD)和4%(NC)，但 THPP組與 Graves’病組及正常對(duì)照組相比，兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在SCN4A、KCNE3的基因突變研究中未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)THPP組rs12688628的G等位基因高于NC組、GD組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與泰國(guó)Jongjaroenprasert等人報(bào)道［6］一致。rs12688628 基因位點(diǎn)的多態(tài)性位于X染色體GABRA3基因的3號(hào)內(nèi)含子中，眾所周知，THPP多發(fā)生于男性，X染色體基因的多態(tài)性也許可部分解釋這種臨床特征。該位點(diǎn)與THPP的相關(guān)性提示可能附近存在其他的致病等位基因，或者該位點(diǎn)本身就是THPP的致病易感基因，這種多態(tài)性可以調(diào)節(jié)GABRA3或附近基因的表達(dá)。以往有多囊卵巢的內(nèi)含子基因可通過(guò)表達(dá)后調(diào)節(jié)另一個(gè)下游基因的表達(dá)導(dǎo)致該病發(fā)生的報(bào)道。GABRA3基因是氯通道蛋白家族的一員。該基因高度表達(dá)于神經(jīng)元及神經(jīng)肌肉接頭處，它的突變?cè)赗ett綜合征中有所報(bào)道［7］，在基因表達(dá)庫(kù)中，也明確指出GABRA3可表達(dá)于骨骼肌的多個(gè)位點(diǎn)［8］。甲狀腺功能亢進(jìn)本身被認(rèn)為是THPP患者發(fā)病的一個(gè)始動(dòng)因素。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明甲狀腺素水平可影響GABAR基因分子的轉(zhuǎn)錄，影響其與GABA受體在神經(jīng)元組織及神經(jīng)肌肉接處的結(jié)合位點(diǎn)［9］，然而目前還沒(méi)有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)直接證實(shí)甲狀腺素對(duì)肌細(xì)胞中GABA受體表達(dá)的影響，因此GABA受體在THPP患者中的作用還不明了，功能研究有待展開(kāi)進(jìn)一步闡述。

與HPP組相比，雖THPP組G等位基因頻率高于后者，但統(tǒng)計(jì)分析比較無(wú)明顯差異，該結(jié)果也許提示GABRA位點(diǎn)的多態(tài)性使眾多原因?qū)е碌牡外浶灾芷谛月楸曰颊呤馔就瑲w，簡(jiǎn)言之，GABRA的位點(diǎn)多態(tài)性使患者易患低鉀性麻痹，但尚需進(jìn)一步分子生物學(xué)研究證實(shí)。

綜上所述，在中國(guó)南方漢族人群中發(fā)現(xiàn)GABRA3基因 rs12688628(G/T)位點(diǎn)多態(tài)性與THPP發(fā)病相關(guān)，GABRA3基因可能是THPP的易感基因，但這一結(jié)論尚需更大的樣本、家系研究來(lái)加以驗(yàn)證。

［1］Chatot-Henry C，Smadia D，Longhi R，et al．Thyrotoxic Periodic Paralysis:two new cases in blacks［J］．Rev Med Interne，2000，21(7):632－634．

［2］Kim SH，Kim UK，Chae JJ，et al．Identification of mutations including de novo mutations in Korean patients with hypokalaemic periodic paralysis［J］．Nephrol Dial Transplant，2001，16:939 － 944．

［3］Chen L，Lang D，Ran XW，et al．Clinical and molecular analysis of Chinese patients with thyrotoxic periodic paralysis［J］．Eur Neurol，2003，49:227 －230．

［4］Ng WY，Lui KF，Thai AC，et al．Absence of ion channels CACN1AS and SCN4A mutations in thyrotoxic hypokalemic periodic paralysis［J］．Thyriod，2004，14:187 －190．

［5］Kung AW，Lau KS，F(xiàn)ong GC，et al．Association of novel single nucleotide polymorphisms in the calcium channel α1 subunit gene(Ca(v)，1．1)and thyrotoxic periodic paralysis［J］．J Clin Endocrinol Metabol，2004，89:1340 －1345．

［6］Jongjaroenprasert W，Chanprasertyotin S，Butadej S，et al．Association of genetic variants in GABRA3 gene and thyrotoxic hypokalaemic periodic paralysis in Thai population［J］．Clin Endocrinol(Oxf)，2008，68(4):646－651．

［7］Amir R，Dahle EJ，Toriolo D，et al．Candidate gene analysis in Rett syndrome and the identification of 21 SNPs IN Xq［J］．Am J Med Genet，2000，90:69 － 71．

［8］Kang PB，Kho AT，Sanoudou D，et al．Variations in gene expression among different types of human skeletal muscle［J］．Muscle Nerve，2005，32:483 －491．

［9］Wiens SC，Trudeau VI．Thyroid hormone and γ-aminobutyric acid(GABA)interactions in neuroendocrine systems［J］．Comp Biochem Physiol，A Mol Integr Physiol，2006，144:332 － 344．