郭 哲,高興華,夏立新,王雅坤,馬麗娟,何春滌,陳洪鐸
肝臟在體內平衡被破壞時,會合成一組急性期蛋白,其作用是參與宿主對感染及損傷組織修復中的防御,進而保持體內平衡[1]。結合珠蛋白(Hp)是急性期蛋白之一,在肺、肝、腎上腺、脂肪組織、輸尿管、附睪、卵巢、頜下腺、皮膚中均有表達[2-3]。正常小鼠的Hp mRNA表達于表皮角質形成細胞和毛囊上皮細胞中[4]。Hp有抗氧化、抗炎作用[5-7],對淋巴細胞功能有很強的免疫抑制作用。Xie等[8]發(fā)現(xiàn),Hp通過阻止朗格漢斯細胞功能轉換和激活T細胞來干預朗格漢斯細胞,起到抑制朗格漢斯細胞功能的作用。Arredouani等[9]發(fā)現(xiàn),接觸性皮炎血中Hp濃度升高。本文觀察甘草甜素處理后的接觸性皮炎小鼠皮膚中的Hp表達改變,現(xiàn)報道如下。
1.1 實驗動物 BALB/c小鼠126只,由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供。均為SPF級雌性,6~8周,體質量(20±2)g。
1.2 實驗儀器 pH計(美國 Queue SystemsTM2711型);解剖顯微鏡(南匯光學儀器廠);電熱恒溫水箱(河北黃驊航天儀器廠,TDW-2002型);電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器公司,DH3600A型);光學顯微鏡(日本Olympus);深低溫冰箱(日本SANYO,Altra Low);紫外分光光度計(美國Spectronic GeneSys TM 2711型);電泳儀(北京六一儀器廠,DYY-Ⅲ2型);電泳槽(北京六一儀器廠,DYY-Ⅲ2型);全能型高性能臺式冷凍離心機(德國Heaeus,Biofuge Stratos);組織勻漿機(德國Heidohp,Diax 900型);PCR擴增儀(德國Biometra,T-Gradient);紫外凝膠成像系統(tǒng)(英國 Gel workers eD,UVP GDS8000)。
1.3 主要試劑 甘草甜素(GL,商品名:美能,日本美能發(fā)源制藥公司。2 mL/支,含GL 40 mg)。地塞米松磷酸鈉注射液(鄭州紅惠制藥有限公司,1 mL/支,2 mg/mL)。RT-PCR試劑:Trizol RNA提取試劑(Invitrogen公司)和 RT-PCR試劑盒(Takara公司)。原位雜交試劑:Haptoglobin原位雜交檢測試劑盒(MK1806)購自武漢博士德公司。引物合成:兩對引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR擴增用引物見表1。
2.1 小鼠接觸性皮炎模型的建立[10]小鼠于實驗前1 d用脫毛劑除去腹部毛,實驗第1天和第2天于每只小鼠去毛部位涂1%二硝基氯苯(DNCB,溶于4∶1丙酮∶橄欖油)50 μL各一次致敏。實驗第6天,病側耳內外側各涂0.5%DNCB 10 μL 1次激發(fā);右耳內外側各涂4∶1丙酮∶橄欖油10 μL 1次,作為對照。
表1 PCR擴增用引物
2.2 動物分組 將126只小鼠隨機分成7組,每組18只,分別為生理鹽水組,GL 5、10、20、40、80 mg/kg,地塞米松1 mg/kg組(Dexa組)。在激發(fā)后腹腔注射藥物,每天1次,每次0.2 mL,連續(xù)3 d。在激發(fā)后24、48、72 h用環(huán)鉆取下的左右耳皮損稱重后分成2份,一份用于原位雜交,另一份于-70℃凍存,以備提取總RNA。
2.3 小鼠皮膚的真表皮分離[10]用刀片刮除小鼠耳朵表面的皮脂和皮屑,除去皮下脂肪。PBS沖洗后,用鑷子分離小鼠耳的兩層皮膚,刮除軟骨,切成0.5 cm×0.5 cm小塊,加入EDTA分離液中37℃水浴,1 h后取出皮片將真表皮分開,留做原位雜交。
2.4 RT-PCR操作步驟
2.4.1 組織總RNA的提取 按照每100 mg組織中加1 mL trizol試劑,將分離好的表皮放入適量trizol試劑中,在冰浴中用勻漿機進行勻漿。勻漿速度為4檔。將勻漿后的樣品,冰浴5 min。按照每1 mL trizol試劑中加入0.2 mL氯仿的標準,加入適量氯仿,用力搖晃15 s,冰浴3 min。4℃以10 000 r/min離心15 min。離心后將上層無色水相移入另一新管中,按照每1 mL trizol試劑中加入0.5 mL異丙醇的標準,加入適量異丙醇。冰浴20 min。4℃以10 000 r/min離心10 min。去除上清,按照每1 mL trizol試劑中加入1 mL 75%乙醇的標準,加入適量75%乙醇。渦旋標本。4℃下,以6 000 r/min離心5 min。去除上清,空氣中干燥 10 min。用0.1%DEPC水10 μL溶解RNA。
2.4.2 RNA濃度和純度測定 取1 μL RNA溶液,用0.1%DEPC水稀釋至80 μL,在紫外分光光度儀上測定RNA溶液在260 nm和280 nm處的光密度(OD)值。RNA濃度(μg/mL)=OD260×稀釋倍數×40/1 000(μg/mL)。RNA純度=OD260/ OD280,當OD260/OD280≥1.6時,認為所提取的RNA質量較好,能夠進行后續(xù)操作。
2.4.3 RT-PCR反應 ①RT反應體系:10×RT緩沖液1 μL,25 mM MgCl22 μL,dNTP混合物(各10 mM)1 μL,逆轉錄酶0.5 μL,RNA酶抑制劑0.25 μL,Random 9 mers 0.5 μL,總RNA(≤500 ng)2 μL,加0.1%DEPC水至總容積10 μL。②RT反應條件為:30℃ 10 min,42℃ 30 min,99℃5 min,5℃5 min,1循環(huán)。③PCR反應體系:cDNA 10 μL,5×PCR緩沖液10 μL,Taq DNA聚合酶0.25 μL,20 pmol的上游或下游引物各0.5 μL,加0.1%DEPC水至總容積50 μL。④PCR反應條件為:94℃2 min,1循環(huán);94℃40 s,60℃40 s,72℃1 min,32循環(huán);72℃8 min,1循環(huán);4℃5 min,1循環(huán)。
2.4.4 Hp引物 上 游:5'-ACCTTAAACG ACGAGAAGCAATGG-3';下游:5'-AGCCAGACACGTAGCCCaCACG-3',片段大小為475 bp。內對照βactin:上游:5'-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3';下游:5'-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3',片段大小為540 bp。
2.4.5 PCR產物檢測 將1.5%瓊脂糖凝膠置于含0.5×TBE的電泳槽中,取10 μL擴增引物與2 μL 6×上樣混合液混合后上樣。溴化乙啶染色。電泳結束后,在紫外凝膠成像系統(tǒng)上照相。
2.4.6 質量控制 設立內對照、空白和陽性對照。內對照:用β-actin引物擴增??瞻讓φ?用0.1%DEPC水代替RNA作為模板,進行RT-PCR反應。陽性對照:從小鼠肝臟組織提取RNA作為模板,進行RT-PCR反應。
2.4.7 結果判定 染色后的產物用 FlourChen Gel Imaging System(Alpha America)進行圖像分析。結果用Hp擴增產物與內對照β-actin擴增產物密度之比來表示,稱為Hp相對轉錄產物或Hp mRNA水平。每一密度值為4次獨立實驗所得平均值。每一實驗在相同條件下進行。結果以±s表示。
2.5 原位雜交檢測
2.5.1 操作步驟 ①表皮用4%多聚甲醛固定液室溫固定30 min,蒸餾水充分洗滌。②將表皮放入新鮮配制的0.5%H2O2的甲醇溶液中,室溫處理30 min;蒸餾水洗滌3次。③用3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶37℃消化1 min,蒸餾水洗滌1次。④每張片子加預雜交液20 μL后于37℃恒溫箱孵育4 h。⑤每張片子加含Hp寡核苷酸探針的雜交液20 μL,蓋上原位雜交專用的蓋玻片,42℃恒溫箱內過夜。⑥37℃ 2×SSC沖洗5 min×2,0.5×SSC沖洗15 min×1,0.2×SSC沖洗15 min ×1;加封閉液,37℃濕盒內孵育30 min。⑦加生物素化鼠抗地高辛抗體,37℃濕盒內孵育60 min,PBS沖洗5 min×4。⑧加SABC(鏈霉親合素生物素復合體),37℃濕盒內孵育20 min,PBS沖洗5 min×4。⑨加生物素化過氧化物酶,37℃濕盒內孵育20 min,PBS沖洗5 min×4。⑩加底物AEC (3-氨基-9-乙基卡巴唑)后室溫顯色30 min,蒸餾水終止。在解剖顯微鏡下鋪片,自然風干后,甘油明膠封片。
2.5.2 質量控制 設立陽性對照和陰性對照。陽性對照為小鼠肝臟組織,陰性對照為不含Hp mRNA的小鼠心臟組織。
2.5.3 結果判定 對每個標本進行觀察,胞漿著色呈橘紅色為Haptoglobin mRNA陽性。染色結果分5級:無染色,為陰性(-);輕微染色,為弱陽性(±);染色較淺,為陽性(+);染色較深,為較強陽性(++);染色深,為強陽性(+++)。
3.1 RT-PCR結果 見表2。激發(fā)后24 h,與生理鹽水組相比,GL 5 mg/kg和10 mg/kg組小鼠表皮475 bp處擴增帶表達明顯增強,GL 80 mg/kg和Dexa組擴增帶明顯減弱。激發(fā)后48 h,與生理鹽水組相比,GL 5 mg/kg和10 mg/kg組小鼠表皮475 bp處擴增帶仍表達增強,GL 80 mg/kg和Dexa未見擴增帶。激發(fā)后72 h,與生理鹽水組相比,各組表皮均未見擴增帶??傮w上看,48 h擴增帶明顯弱于24 h。真皮中各時間點均未見Haptoglobin mRNA表達。內對照:所有標本均可用β-actin擴增出540 bp片段??瞻讓φ?未擴增出475 bp片段或540 bp片段。陽性對照:小鼠肝臟組織用Hp引物擴增出475 bp片段,用β-actin擴增出540 bp片段。
3.2 原位雜交結果 見表3。激發(fā)后24 h,GL 5 mg/kg和10 mg/kg組染色強于生理鹽水組;GL 20 mg/kg和40 mg/kg組染色強度與生理鹽水組相似;GL 80 mg/kg和Dexa組染色弱于生理鹽水組。激發(fā)后48 h,染色強度普遍弱于24 h,GL 5 mg/kg、10 mg/kg組染色強度強于生理鹽水組; GL 20 mg/kg和40 mg/kg組染色強度與生理鹽水組相似;GL 80 mg/kg和Dexa組未見陽性染色。激發(fā)后72 h各組均未見陽性染色。各組真皮內未見Hp mRNA表達。陽性對照:小鼠肝細胞胞漿明顯紅染。陰性對照:無胞漿特異性染色出現(xiàn)。
表2 GL對接觸性皮炎小鼠表皮Hp mRNA表達的相對值(RT-PCR結果)
表3 GL對接觸性皮炎小鼠表皮Hp mRNA表達強度的影響(原位雜交結果)
無論是用RT-PCR還是原位雜交方法,筆者發(fā)現(xiàn),激發(fā)后 24、48 h,與生理鹽水組相比,GL 5 mg/kg、10 mg/kg組 Hp mRNA表達增強,GL 80 mg/kg和地塞米松組表達減弱。說明甘草甜素雙相調節(jié)接觸性皮炎小鼠表皮內結合珠蛋白的表達。低劑量GL能增強小鼠表皮內Hp mRNA的表達,高劑量GL和地塞米松能減弱小鼠表皮內Hp mRNA的表達。
LC本身不能合成Hp,通過胞吞及胞吐方式攝取和排出Hp,而角質形成細胞能合成Hp[11]。Kim等[12]認為,Hp抑制表皮內不成熟的LC向成熟的抗原遞呈細胞轉變,具有免疫調節(jié)和抗炎作用,可能是抑制炎癥部位過度的炎癥反應的反饋因子之一。筆者以前的實驗發(fā)現(xiàn),GL5 mg/kg、10 mg/kg組可以使LC密度降低,同時減輕炎癥反應,而本次實驗又顯示,兩組表皮內Hp mRNA表達增強,因此,推測Hp可能與LC的密度降低有關。Hp mRNA表達增強,意味著更多的Hp發(fā)揮抗炎作用,使不成熟的LC向成熟的抗原遞呈細胞轉變受到抑制,從而使接觸性皮炎小鼠的炎癥反應減輕。GL 80 mg/kg和Dexa組Hp mRNA表達減弱,發(fā)揮抗炎作用的Hp減少,這也與臨床實際情況相一致。筆者認為,GL增加Hp mRNA表達,可能是GL素治療接觸性皮炎的機制之一。Dexa組Hp mRNA表達減弱,說明甘草甜素和地塞米松對Hp的影響是通過不同的機制實現(xiàn)的,兩者治療接觸性皮炎的機制也是不同的。
因為皮膚中Hp含量少,RT-PCR方法所用標本不是新鮮標本,原位雜交方法用的是新鮮標本,此外,應用的是鋪片而不是切片,所以本文用原位雜交的方法檢測Hp mRNA的表達,兩種方法各有不足,但結果一致,說明從mRNA水平對Hp進行的檢測是真實的。
總之,GL能增強小鼠接觸性皮炎表皮內Hp mRNA的表達,說明GL能對急性期蛋白發(fā)揮藥理作用,這可能是其治療接觸性皮炎的機制之一。
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