郭 哲，高興華，夏立新，王雅坤，馬麗娟，何春滌，陳洪鐸

肝臟在體內平衡被破壞時，會合成一組急性期蛋白，其作用是參與宿主對感染及損傷組織修復中的防御，進而保持體內平衡［1］。結合珠蛋白(Hp)是急性期蛋白之一，在肺、肝、腎上腺、脂肪組織、輸尿管、附睪、卵巢、頜下腺、皮膚中均有表達［2-3］。正常小鼠的Hp mRNA表達于表皮角質形成細胞和毛囊上皮細胞中［4］。Hp有抗氧化、抗炎作用［5-7］，對淋巴細胞功能有很強的免疫抑制作用。Xie等［8］發(fā)現(xiàn)，Hp通過阻止朗格漢斯細胞功能轉換和激活T細胞來干預朗格漢斯細胞，起到抑制朗格漢斯細胞功能的作用。Arredouani等［9］發(fā)現(xiàn)，接觸性皮炎血中Hp濃度升高。本文觀察甘草甜素處理后的接觸性皮炎小鼠皮膚中的Hp表達改變，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 實驗動物 BALB/c小鼠126只，由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供。均為SPF級雌性，6～8周，體質量(20±2)g。

1.2 實驗儀器 pH計(美國 Queue SystemsTM2711型);解剖顯微鏡(南匯光學儀器廠);電熱恒溫水箱(河北黃驊航天儀器廠，TDW-2002型);電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器公司，DH3600A型);光學顯微鏡(日本Olympus);深低溫冰箱(日本SANYO，Altra Low);紫外分光光度計(美國Spectronic GeneSys TM 2711型);電泳儀(北京六一儀器廠，DYY-Ⅲ2型);電泳槽(北京六一儀器廠，DYY-Ⅲ2型);全能型高性能臺式冷凍離心機(德國Heaeus，Biofuge Stratos);組織勻漿機(德國Heidohp，Diax 900型);PCR擴增儀(德國Biometra，T-Gradient);紫外凝膠成像系統(tǒng)(英國 Gel workers eD，UVP GDS8000)。

1.3 主要試劑 甘草甜素(GL，商品名:美能，日本美能發(fā)源制藥公司。2 mL/支，含GL 40 mg)。地塞米松磷酸鈉注射液(鄭州紅惠制藥有限公司，1 mL/支，2 mg/mL)。RT-PCR試劑:Trizol RNA提取試劑(Invitrogen公司)和 RT-PCR試劑盒(Takara公司)。原位雜交試劑:Haptoglobin原位雜交檢測試劑盒(MK1806)購自武漢博士德公司。引物合成:兩對引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR擴增用引物見表1。

2 方法

2.1 小鼠接觸性皮炎模型的建立［10］小鼠于實驗前1 d用脫毛劑除去腹部毛，實驗第1天和第2天于每只小鼠去毛部位涂1%二硝基氯苯(DNCB，溶于4∶1丙酮∶橄欖油)50 μL各一次致敏。實驗第6天，病側耳內外側各涂0.5%DNCB 10 μL 1次激發(fā);右耳內外側各涂4∶1丙酮∶橄欖油10 μL 1次，作為對照。

表1 PCR擴增用引物

2.2 動物分組 將126只小鼠隨機分成7組，每組18只，分別為生理鹽水組，GL 5、10、20、40、80 mg/kg，地塞米松1 mg/kg組(Dexa組)。在激發(fā)后腹腔注射藥物，每天1次，每次0.2 mL，連續(xù)3 d。在激發(fā)后24、48、72 h用環(huán)鉆取下的左右耳皮損稱重后分成2份，一份用于原位雜交，另一份于－70℃凍存，以備提取總RNA。

2.3 小鼠皮膚的真表皮分離［10］用刀片刮除小鼠耳朵表面的皮脂和皮屑，除去皮下脂肪。PBS沖洗后，用鑷子分離小鼠耳的兩層皮膚，刮除軟骨，切成0.5 cm×0.5 cm小塊，加入EDTA分離液中37℃水浴，1 h后取出皮片將真表皮分開，留做原位雜交。

2.4 RT-PCR操作步驟

2.4.1 組織總RNA的提取 按照每100 mg組織中加1 mL trizol試劑，將分離好的表皮放入適量trizol試劑中，在冰浴中用勻漿機進行勻漿。勻漿速度為4檔。將勻漿后的樣品，冰浴5 min。按照每1 mL trizol試劑中加入0.2 mL氯仿的標準，加入適量氯仿，用力搖晃15 s，冰浴3 min。4℃以10 000 r/min離心15 min。離心后將上層無色水相移入另一新管中，按照每1 mL trizol試劑中加入0.5 mL異丙醇的標準，加入適量異丙醇。冰浴20 min。4℃以10 000 r/min離心10 min。去除上清，按照每1 mL trizol試劑中加入1 mL 75%乙醇的標準，加入適量75%乙醇。渦旋標本。4℃下，以6 000 r/min離心5 min。去除上清，空氣中干燥 10 min。用0.1%DEPC水10 μL溶解RNA。

2.4.2 RNA濃度和純度測定 取1 μL RNA溶液，用0.1%DEPC水稀釋至80 μL，在紫外分光光度儀上測定RNA溶液在260 nm和280 nm處的光密度(OD)值。RNA濃度(μg/mL)=OD260×稀釋倍數×40/1 000(μg/mL)。RNA純度=OD260/ OD280，當OD260/OD280≥1.6時，認為所提取的RNA質量較好，能夠進行后續(xù)操作。

2.4.3 RT-PCR反應 ①RT反應體系:10×RT緩沖液1 μL，25 mM MgCl22 μL，dNTP混合物(各10 mM)1 μL，逆轉錄酶0.5 μL，RNA酶抑制劑0.25 μL，Random 9 mers 0.5 μL，總RNA(≤500 ng)2 μL，加0.1%DEPC水至總容積10 μL。②RT反應條件為:30℃ 10 min，42℃ 30 min，99℃5 min，5℃5 min，1循環(huán)。③PCR反應體系:cDNA 10 μL，5×PCR緩沖液10 μL，Taq DNA聚合酶0.25 μL，20 pmol的上游或下游引物各0.5 μL，加0.1%DEPC水至總容積50 μL。④PCR反應條件為:94℃2 min，1循環(huán);94℃40 s，60℃40 s，72℃1 min，32循環(huán);72℃8 min，1循環(huán);4℃5 min，1循環(huán)。

2.4.4 Hp引物 上 游:5'-ACCTTAAACG ACGAGAAGCAATGG-3';下游:5'-AGCCAGACACGTAGCCCaCACG-3'，片段大小為475 bp。內對照βactin:上游:5'-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3';下游:5'-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3'，片段大小為540 bp。

2.4.5 PCR產物檢測 將1.5%瓊脂糖凝膠置于含0.5×TBE的電泳槽中，取10 μL擴增引物與2 μL 6×上樣混合液混合后上樣。溴化乙啶染色。電泳結束后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)上照相。

2.4.6 質量控制 設立內對照、空白和陽性對照。內對照:用β-actin引物擴增?？瞻讓φ?用0.1%DEPC水代替RNA作為模板，進行RT-PCR反應。陽性對照:從小鼠肝臟組織提取RNA作為模板，進行RT-PCR反應。

2.4.7 結果判定 染色后的產物用 FlourChen Gel Imaging System(Alpha America)進行圖像分析。結果用Hp擴增產物與內對照β-actin擴增產物密度之比來表示，稱為Hp相對轉錄產物或Hp mRNA水平。每一密度值為4次獨立實驗所得平均值。每一實驗在相同條件下進行。結果以±s表示。

2.5 原位雜交檢測

2.5.1 操作步驟 ①表皮用4%多聚甲醛固定液室溫固定30 min，蒸餾水充分洗滌。②將表皮放入新鮮配制的0.5%H2O2的甲醇溶液中，室溫處理30 min;蒸餾水洗滌3次。③用3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶37℃消化1 min，蒸餾水洗滌1次。④每張片子加預雜交液20 μL后于37℃恒溫箱孵育4 h。⑤每張片子加含Hp寡核苷酸探針的雜交液20 μL，蓋上原位雜交專用的蓋玻片，42℃恒溫箱內過夜。⑥37℃ 2×SSC沖洗5 min×2，0.5×SSC沖洗15 min×1，0.2×SSC沖洗15 min ×1;加封閉液，37℃濕盒內孵育30 min。⑦加生物素化鼠抗地高辛抗體，37℃濕盒內孵育60 min，PBS沖洗5 min×4。⑧加SABC(鏈霉親合素生物素復合體)，37℃濕盒內孵育20 min，PBS沖洗5 min×4。⑨加生物素化過氧化物酶，37℃濕盒內孵育20 min，PBS沖洗5 min×4。⑩加底物AEC (3-氨基-9-乙基卡巴唑)后室溫顯色30 min，蒸餾水終止。在解剖顯微鏡下鋪片，自然風干后，甘油明膠封片。

2.5.2 質量控制 設立陽性對照和陰性對照。陽性對照為小鼠肝臟組織，陰性對照為不含Hp mRNA的小鼠心臟組織。

2.5.3 結果判定 對每個標本進行觀察，胞漿著色呈橘紅色為Haptoglobin mRNA陽性。染色結果分5級:無染色，為陰性(-);輕微染色，為弱陽性(±);染色較淺，為陽性(+);染色較深，為較強陽性(++);染色深，為強陽性(+++)。

3 結果

3.1 RT-PCR結果 見表2。激發(fā)后24 h，與生理鹽水組相比，GL 5 mg/kg和10 mg/kg組小鼠表皮475 bp處擴增帶表達明顯增強，GL 80 mg/kg和Dexa組擴增帶明顯減弱。激發(fā)后48 h，與生理鹽水組相比，GL 5 mg/kg和10 mg/kg組小鼠表皮475 bp處擴增帶仍表達增強，GL 80 mg/kg和Dexa未見擴增帶。激發(fā)后72 h，與生理鹽水組相比，各組表皮均未見擴增帶?？傮w上看，48 h擴增帶明顯弱于24 h。真皮中各時間點均未見Haptoglobin mRNA表達。內對照:所有標本均可用β-actin擴增出540 bp片段?？瞻讓φ?未擴增出475 bp片段或540 bp片段。陽性對照:小鼠肝臟組織用Hp引物擴增出475 bp片段，用β-actin擴增出540 bp片段。

3.2 原位雜交結果 見表3。激發(fā)后24 h，GL 5 mg/kg和10 mg/kg組染色強于生理鹽水組;GL 20 mg/kg和40 mg/kg組染色強度與生理鹽水組相似;GL 80 mg/kg和Dexa組染色弱于生理鹽水組。激發(fā)后48 h，染色強度普遍弱于24 h，GL 5 mg/kg、10 mg/kg組染色強度強于生理鹽水組; GL 20 mg/kg和40 mg/kg組染色強度與生理鹽水組相似;GL 80 mg/kg和Dexa組未見陽性染色。激發(fā)后72 h各組均未見陽性染色。各組真皮內未見Hp mRNA表達。陽性對照:小鼠肝細胞胞漿明顯紅染。陰性對照:無胞漿特異性染色出現(xiàn)。

表2 GL對接觸性皮炎小鼠表皮Hp mRNA表達的相對值(RT-PCR結果)

表3 GL對接觸性皮炎小鼠表皮Hp mRNA表達強度的影響(原位雜交結果)

4 討論

無論是用RT-PCR還是原位雜交方法，筆者發(fā)現(xiàn)，激發(fā)后 24、48 h，與生理鹽水組相比，GL 5 mg/kg、10 mg/kg組 Hp mRNA表達增強，GL 80 mg/kg和地塞米松組表達減弱。說明甘草甜素雙相調節(jié)接觸性皮炎小鼠表皮內結合珠蛋白的表達。低劑量GL能增強小鼠表皮內Hp mRNA的表達，高劑量GL和地塞米松能減弱小鼠表皮內Hp mRNA的表達。

LC本身不能合成Hp，通過胞吞及胞吐方式攝取和排出Hp，而角質形成細胞能合成Hp［11］。Kim等［12］認為，Hp抑制表皮內不成熟的LC向成熟的抗原遞呈細胞轉變，具有免疫調節(jié)和抗炎作用，可能是抑制炎癥部位過度的炎癥反應的反饋因子之一。筆者以前的實驗發(fā)現(xiàn)，GL5 mg/kg、10 mg/kg組可以使LC密度降低，同時減輕炎癥反應，而本次實驗又顯示，兩組表皮內Hp mRNA表達增強，因此，推測Hp可能與LC的密度降低有關。Hp mRNA表達增強，意味著更多的Hp發(fā)揮抗炎作用，使不成熟的LC向成熟的抗原遞呈細胞轉變受到抑制，從而使接觸性皮炎小鼠的炎癥反應減輕。GL 80 mg/kg和Dexa組Hp mRNA表達減弱，發(fā)揮抗炎作用的Hp減少，這也與臨床實際情況相一致。筆者認為，GL增加Hp mRNA表達，可能是GL素治療接觸性皮炎的機制之一。Dexa組Hp mRNA表達減弱，說明甘草甜素和地塞米松對Hp的影響是通過不同的機制實現(xiàn)的，兩者治療接觸性皮炎的機制也是不同的。

因為皮膚中Hp含量少，RT-PCR方法所用標本不是新鮮標本，原位雜交方法用的是新鮮標本，此外，應用的是鋪片而不是切片，所以本文用原位雜交的方法檢測Hp mRNA的表達，兩種方法各有不足，但結果一致，說明從mRNA水平對Hp進行的檢測是真實的。

總之，GL能增強小鼠接觸性皮炎表皮內Hp mRNA的表達，說明GL能對急性期蛋白發(fā)揮藥理作用，這可能是其治療接觸性皮炎的機制之一。

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