楊薈敏 祝佳瑋 趙宸龍 張晨光 張 紅 趙文明

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)院細(xì)胞生物學(xué)系，肝臟保護(hù)與再生調(diào)節(jié)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069;2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)院免疫學(xué)系，北京100069;3.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京100069)

含有巰基/二硫鍵的化合物在體內(nèi)發(fā)揮著多種不同的作用，可參與調(diào)控細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，蛋白質(zhì)以及其他分子化合物等的組成、轉(zhuǎn)運(yùn)和功能等。體內(nèi)含有巰基/二硫鍵的化合物有半胱氨酸/胱氨酸(cysteine/ cystine，Cys/CySS)，谷胱甘肽氧化態(tài)/還原態(tài)(reduced glutathione/oxidized glutathione，GSH/GSSG)以及硫氧還原蛋白1和2(thioredoxin1/2，Trx1/2)［1］等，這些物質(zhì)在體內(nèi)環(huán)境中以氧化態(tài)和還原態(tài)的形式存在，處于動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程中并最終達(dá)到一個(gè)相對(duì)氧化還原平衡的狀態(tài)。一旦這種平衡狀態(tài)被破壞，機(jī)體即啟動(dòng)與超氧自由基產(chǎn)物的相關(guān)機(jī)制，從而影響脂蛋白修飾、轉(zhuǎn)換和細(xì)胞功能及代謝素產(chǎn)生損傷［2-4］，而且可對(duì)葡萄糖和糖蛋白的自身氧化作用和抗氧化酶的糖化作用產(chǎn)生影響。

氧化應(yīng)激參與體內(nèi)多種生理活動(dòng)及疾病的發(fā)生［5］，因此，尋找能夠探測(cè)體內(nèi)氧化還原狀態(tài)生物學(xué)指標(biāo)的簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確的方法，對(duì)研究氧化應(yīng)激參與的體內(nèi)生理活動(dòng)極為重要。目前，檢測(cè)體內(nèi)某種蛋白氧化還原狀態(tài)的方法很多。應(yīng)用比較廣泛的主要有氧化還原蛋白免疫印記法［5］;生物素標(biāo)記的碘乙酰胺蛋白免疫印記法［6-7］;此外還有一些相關(guān)的測(cè)定方法如：酶循環(huán)法［8］、磁共振光譜檢測(cè)法［9］以及電化學(xué)測(cè)定法［10］等。但這些方法在某些方面如檢測(cè)靈敏度，相對(duì)精確定量蛋白的氧化還原狀態(tài)等受到實(shí)驗(yàn)條件的限制，具有一定的局限性。并且在同時(shí)檢測(cè)體內(nèi)多種物質(zhì)的氧化還原狀態(tài)上也受到一定的限制。另外，目前國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)［8-10］報(bào)道主要集中在用HPLC檢測(cè)血漿中還原態(tài)物質(zhì)如GSH、Cys等的含量。因此，尋找能夠同時(shí)測(cè)定體內(nèi)多種氧化及還原狀態(tài)物質(zhì)的方法對(duì)準(zhǔn)確反映體內(nèi)氧化應(yīng)激的狀態(tài)極為重要。本方法可同時(shí)檢測(cè)血漿中含巰基/二硫鍵化合物 Cys/CySS和GSH/GSSG形成的氧化還原對(duì)的含量，并根據(jù)能斯特方程計(jì)算出相應(yīng)的氧化還原電勢(shì)。此方法是用碘乙酸封閉血漿中自由的巰基，通過(guò)丹磺酰氯衍生化后，利用HPLC進(jìn)行分離檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1)實(shí)驗(yàn)材料：水合紅菲繞啉二磺酸鈉(bathophenanthroline disulfonic acid disodium salt hydrate，BPDS)，丹磺酰氯，L-絲氨酸，Cys，CySS，GSH，GSSG，70%高氯酸(HPLC級(jí))，甲醇(HPLC級(jí))均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。內(nèi)參谷氨酰谷氨酸(γ-glutamylglutamate，γ-GG)購(gòu)于美國(guó) MP Biomedicals公司，碘乙酸(iodoacetic acid，IAA)，肝素鈉購(gòu)于北京信德科興科學(xué)器材有限責(zé)任公司，硼酸、四硼酸鈉、丙酮、氯仿、冰醋酸均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)別。SD雄性大鼠(190～210g)購(gòu)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：2006－0009。

2)儀器：高效液相色譜儀為Wasters 2695，以及熒光檢測(cè)器Wasters 2475(激發(fā)波長(zhǎng)315nm，發(fā)射波長(zhǎng)518nm)。

1.2 主要試劑的配制

1)主要溶液的配制：①含有內(nèi)參的硼酸鹽緩沖液(0.5 mol/L，pH 8.5)：稱取 12.4 g硼酸，19 g Na2B4O7·10 H2O，溶于500 mL雙蒸水中;加入內(nèi)參γ-GG，終濃度為165 μmol/L。②A液的配制：稱取1.53 g L-絲氨酸，25 mg肝素鈉，50 mg BPDS，300 mg IAA溶于10 mL含有內(nèi)參γ-GG的硼酸鹽緩沖液(0.5 mol/L)中，充分混勻(pH 8.0)。分裝為每管150 μL。于－20℃保存。③B液的配制：0.2 mol/L含有10%高氯酸的硼酸液：稱取6.2 g硼酸至300 mL雙蒸水中，加入71 mL 70%高氯酸混勻后，再用雙蒸水定容至500 mL(pH 1.0)。分裝為200 μL/管，于－20℃保存。

2)標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備：精確稱取適量的Cys，CySS，GSH，GSSG溶解于10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，制成濃度均為5 μmol/L的Cys，CySS，GSH，GSSG混合溶液。然后加入IAA和內(nèi)參γ-GG，濃度分別為7.4g/ L和10 μmol/L。分裝，于－20℃保存。

3)血漿樣品的制備：取1 350 μL全血，加入150 μL A液，室溫放置一段時(shí)間，使IAA與巰基充分結(jié)合。將管輕輕倒置2次混合溶液，然后16 000g離心1 min。取上清200 μL，加入200 μL B液，再輕輕將管倒置2次，混勻后于－20℃保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1)樣品的衍生化：將標(biāo)準(zhǔn)樣品及血漿樣品取出，待樣品融化后，16 000g離心2min，取300μL上清置于新離心管中，加入1 mol/L KOH/飽和硼酸鹽溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0±0.2，放置大約3min，充分清除高氯酸鉀。加入300μL丹磺酰氯溶液(20mg/mL丹磺酰氯溶于丙酮，現(xiàn)配現(xiàn)用)，室溫避光16～26 h，加入500μL氯仿，8 000 r/min離心 5min。取上清，于－20℃保存。

2)色譜條件：色譜柱為L(zhǎng)C-NH2硅膠柱(25cm × 4.6mm，5μm，美國(guó)Sigma公司)。流動(dòng)相I為80%甲醇，20%雙蒸水。流動(dòng)相Ⅱ?yàn)?3%甲醇，27%冰醋酸，10%雙蒸水，0.002 5mol/L無(wú)水乙酸鈉。流動(dòng)相梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度程序Tab.1 Procedure of solvent gradient (%)

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測(cè)及其重復(fù)性

為檢測(cè)本方法的可行性及重復(fù)性，我們首先對(duì)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品中各組進(jìn)行了檢測(cè)。按照1.2中2)的方法準(zhǔn)確配制含有5 μmol/L Cys、CySS、GSH、GSSG，和10 μmol/L內(nèi)標(biāo)γ-GG的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品，并將其分為5份，分別測(cè)定各樣品中Cys、CySS、GSH、GSSG以及γ-GG的保留時(shí)間和峰面積。以第1次結(jié)果和第5次結(jié)果為例作圖(圖1)。各組分的保留時(shí)間及峰面積見(jiàn)表2。用于標(biāo)準(zhǔn)定量的內(nèi)標(biāo)γ-GG在保留時(shí)間和峰面積上均顯示了極高的重復(fù)性，RSD值均≤1%，為后期樣品濃度的精確定量提供了基礎(chǔ)。Cys、CySS、GSH、GSSG的保留時(shí)間及峰型的RSD值也都≤10.8%，具有較好的重合性。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明此方法可以準(zhǔn)確檢測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)樣品中各物質(zhì)的含量，并且具有可重復(fù)性。

圖1 HPLC重復(fù)分離、熒光檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品峰值圖Fig.1 Replicated peak of standard were separated and detected by HPLCRed：the result from the first time;Blue：the result from the fifth time;HPLC：high performance liquid chromatography;CySS：cystine;Cys：cysteine;γ-GG：glutamylglutamateGSH：reduced glutathione;GSSG：oxideided glucathione.

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Tab.2 Repeatability of the assay

2.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性檢測(cè)

分別測(cè)定新鮮配制的標(biāo)準(zhǔn)樣品與配制后置入－20℃保存90d的標(biāo)準(zhǔn)品，并對(duì)第1天和第90天的樣品濃度進(jìn)行檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間凍存后，與新鮮制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品相比，GSH、GSSG、Cys、CySS的 RSD值分別為 7.5%，6.9%，6.4%和3.9%均小于10%，表明本方法制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品在－20℃環(huán)境中具有較好的穩(wěn)定性。

2.3 血漿樣品中Cys/CySS和GSH/GSSG的檢測(cè)

根據(jù)血漿樣品的制備方法1.2中3)制備HPLC大鼠血漿樣品，并按照1.3實(shí)驗(yàn)方法分別檢測(cè)混合標(biāo)準(zhǔn)樣品、正常大鼠及帕金森大鼠模型的血漿樣品中Cys、 CySS、GSH、GSSG的含量，詳見(jiàn)圖2。利用內(nèi)標(biāo)法公式：

內(nèi)標(biāo)γ-GG(10μmol/L)，標(biāo)準(zhǔn)樣品中各物質(zhì)的濃度(5μmol/L)，可 分 別 計(jì) 算 正 常 大 鼠 中 Cys (20.68 μmol/L)、 CySS (34.00μmol/L)、 GSH (25.3μmol/L)、GSSG(15.8μmol/L)和帕金森模型大鼠中 Cys(22.99μmol/L)、CySS(28.55μmol/L)、GSH (7.8μmol/L)、GSSG(18.5μmol/L)的含量。帕金森大鼠模型動(dòng)物血漿中可能存在氧化還原電勢(shì)的改變。

圖2 HPLC分離、熒光檢測(cè)大鼠血漿中Cys，CySS，GSH，GSSG峰值圖Fig.2 Peaks of Cys，CySS，GSH，GSSG，in rat plasma were separated and detected by HPLCA：standard mixture containing each of Cys，CySS，GSH，GSSG at 5μmol/L and 10μmol/L internal standard，γ-GG;B：plasma sample from a healthy rat;C：plasma sample from a rat with Parkinson's disease;HPLC：high performance liquid chromatography;Cys：cysteine;CySS：cystine;GSH：reduced glutathione; GSSG：oxidized glutathione.

2.4 樣品中氧化還原電勢(shì)的計(jì)算

根據(jù)圖2中各實(shí)驗(yàn)組測(cè)得的各組分的濃度，利用能斯特方程：Cys/CySSEh=－250+30 log［(CySS)/ (Cys)2］，GSH/GSSGEh=－264+30 log［(GSSG)/ (GSH)2)分別計(jì)算大鼠血漿樣品中的氧化還原電勢(shì)(圖3)。當(dāng)血漿pH值為7.4時(shí)，正常大鼠的Cys/ CySSEh和GSH/GSSGEh分別為(－120.01±18.08) mV和(－131.60±2.45)mV，而在帕金森大鼠動(dòng)物模型中Cys/CySSEh和GSH/GSSGEh分別為(－96.34± 9.98)mV和(－94.27±4.56)mV。與正常大鼠相比，帕金森大鼠動(dòng)物模型血漿中 Cys/CySSEh和 GSH/ GSSGEh均發(fā)生了一定程度的氧化，進(jìn)一步量化了帕金森大鼠動(dòng)物模型中的氧化應(yīng)激程度。

圖3 不同組間大鼠Eh值柱狀圖Fig.3 Histograms of rat plasma Eh in different experimental groupsControl：rats injected with DMSO;Model：rotenone-induced rat model of PD;male Sprague-Dawley rats received rotenone(6 μg) injection for 3 weeks;Eh：redox potentials;Cys：cysteine;CySS：cystine;GSH：reduced glutathione;GSSG：oxidized glutathione.

3 討論

含巰基/二硫鍵化合物在體內(nèi)分布廣泛，其多功能性也越來(lái)越引起廣泛的注意。特別是近年來(lái)，活性氧、自由基以及氧化還原調(diào)控在體內(nèi)的研究尤為重要［11］。目前國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)［12］報(bào)道的方法主要集中在用HPLC檢測(cè)血漿中還原態(tài)物質(zhì)如GSH、Cys等的含量，未涉及相應(yīng)氧化還原電勢(shì)的檢測(cè)。此外，疾病狀態(tài)下Cys/CySSEh與GSH/GSSGEh并非同時(shí)發(fā)生變化［13］，因此單獨(dú)檢測(cè)其中之一有可能對(duì)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性造成影響。而本方法可同時(shí)測(cè)定血漿內(nèi)氧化態(tài)和還原態(tài)物質(zhì)Cys、CySS、GSH、GSSG的含量，并可反映機(jī)體氧化還原能力重要的量化指標(biāo)(氧化還原電勢(shì))。此方法的建立，為研究巰基依賴的氧化還原相關(guān)信號(hào)［1］提供了更加可靠的依據(jù)。

利用本研究方法制備樣品時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：第一，在－20℃條件下，可維持樣品的穩(wěn)定性4～5個(gè)月，樣品在－80℃條件下，則可穩(wěn)定更長(zhǎng)時(shí)間;第二，在樣品制備過(guò)程中用到的高氯酸，有k+存在時(shí)會(huì)出現(xiàn)沉淀，因此在制備好的樣品中如出現(xiàn)少量沉淀，并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性;第三，為保證色譜柱的使用壽命，可在上機(jī)操作前，適當(dāng)離心棄去沉淀;第四，本研究所用方法是基于陰離子交換柱的原理建立的，帶有不同負(fù)電荷的待測(cè)樣品可以被梯度洗脫下來(lái)。因此實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵在于流動(dòng)相Ⅰ與Ⅱ的比例。決定該比例的主要因素，除樣品所帶電荷數(shù)以外，還有色譜柱的柱齡。我們經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著柱齡的增加，待測(cè)樣品與色譜柱的結(jié)合能力逐漸減弱，為了能夠繼續(xù)達(dá)到較好的分離效果，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，可逐漸降低流動(dòng)相中Ⅱ所占的比例。此外，在制備待測(cè)樣品的過(guò)程中，防止樣品制備過(guò)程中溶血現(xiàn)象的發(fā)生是實(shí)驗(yàn)成功的另一關(guān)鍵部分。因?yàn)榧t細(xì)胞中GSH的含量較血漿中高出很多。一旦樣品制備過(guò)程中出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，樣品需丟棄，否則將嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

此方法可被廣泛用于測(cè)定與氧化應(yīng)激相關(guān)的多種疾病，如肝損傷［14］、動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、皮膚病、糖尿病、呼吸系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［15-17］等，以及在不同營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和不同毒理學(xué)條件下，血漿、支氣管肺泡灌洗液、淋巴液、腦脊液中Cys/CySS和GSH/GSSG氧化還原對(duì)的含量及相應(yīng)的氧化還原電勢(shì)，因而可成為檢測(cè)與氧化應(yīng)激相關(guān)疾病及病理?xiàng)l件下的新的臨床診斷指標(biāo)之一。

［1］ Kemp M，Go Y M，Jones D P.Nonequilibrium thermodynamics of thiol/disulfide redox systems：a perspective on redox systems biology［J］.Free Radic Biol Med，2008，44 (6)：921-937.

［2］ Bursell S E，King G L.The potential use of glutathionyl hemoglobin as a clinical marker of oxidative stress［J］.Clin Chem，2000，46(2)：145-146.

［3］ Baynes J W，Thorpe S R.Role of oxidative stress in diabetic complications：a new perspective on an old paradigm［J］.Diabetes，1999，48(1)：1-9.

［4］ Murr C，F(xiàn)uith L C，Wridner B，et al.Increased neopterin concentrations in patients with cancer：indicator of oxidative stress［J］.Anticancer Res，1999，19(3A)：1721-1728.

［5］ 高衛(wèi)，谷利，楊薈敏，等.硫氧還蛋白-1(Trx1)氧化還原狀態(tài)的檢測(cè)［J］.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2010，26(4)：374-379.

［6］ Go Y M，Ziegler T R，Johnson J M，et al.Selective protection of nuclear thioredoxin-1 and glutathione redox systems against oxidation during glucose and glutamine deficiency in human colonic epithelial cells［J］.Free Radic Biol Med，2007，42(3)：363-370.

［7］ Kim J R，Lee S M，Cho S H，et al.Oxidation of thioredoxin reductase in HeLa cells stimulated with tumor necrosis factoralpha［J］.FEBS Lett，2004，567(2-3)：189-196.

［8］ Mourad T，Min K L，Steghens J P.Measurement of oxidized glutathione by enzymatic recycling coupled to ioluminescent detection［J］.An Biochem，2000，283(2)：146-152.

［9］ Zhao T，Heberlein K，Jonas C，et al.New double quantum coherence filter for localized detection of glutathione in vivo［J］.Magn Reson Med，2006，55(3)：676-680.

［10］Rodriguez-Ariza A，Toribio F，López-Barea J.Rapid determination of glutathione status in fish liver using high-performance liquid chromatography and electrochemical dedection［J］.J Chromatogr B Biomed Appl，1994，656(2)：311-318.

［11］Ou Y，Geng P，Liao G Y，et al.Intracellular GSH and ROS levels may be related to galactose-mediated human lens epithelial cell apoptosis：role of recombinant hirudin variantⅢ［J］.Chem Biol Interact，2009，179(2-3)：103-109.

［12］何忠于，陳劍.利用粉末微電極檢測(cè)谷胱甘肽及L-半胱氨酸［J］.分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2002，18(2)：130-132.

［13］Anderson C L，Iyer S S，Ziegler T R，et al.Control of extracellular cysteine/cystine redox state by HT-29 cells［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2007，293(3)：1069-1075.

［14］張立婷，何琦，熊亞星，等.還原型谷朧甘膚對(duì)氧化應(yīng)激所致肝損傷的作用機(jī)制［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29(8)：15-17.

［15］馮欣，杜宇，潘坤，等.谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶與氧化應(yīng)激［J］.醫(yī)學(xué)研究與教育，2010，27(5)：80-83.

［16］魏劍芬，程燕，陳冬.糖尿病腎病患者血清同型半胱氨酸與氧化應(yīng)激的關(guān)系［J］.天津醫(yī)藥，38(10)：871-873.

［17］夏豫，周瑾，李春林，等.超敏C反應(yīng)蛋白與血清同型半胱氨酸聯(lián)合檢測(cè)診斷冠心病的價(jià)值［J］.臨床誤診誤治，2010，23(12)：1140-1141.