秦紅剛，肖 敏，李 偉，謝紅玲，漆世華，溫文生，吳玉石

(武漢中博生物股份有限公司，武漢 430070)

乙型腦炎又稱日本腦炎(Japenese Epcephalitis B)是一種嗜神經(jīng)性蟲媒病毒乙型腦炎病毒(Japenese Epcephalitis Virus，JEV)引起的人獸共患傳染病，引起人類的腦炎，對(duì)豬的致死率不高，但能引起懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙，公豬發(fā)生睪丸炎［1］。乙型腦炎病毒通常在蚊－豬－蚊等動(dòng)物間循環(huán)，豬是乙型腦炎病毒最重要的自然增殖動(dòng)物，是主要的傳染源。因此對(duì)豬乙型腦炎的防控具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。疫苗的免疫接種是目前防控豬乙型腦炎的重要手段，本文就豬乙型腦炎疫苗的研究現(xiàn)狀做一個(gè)簡(jiǎn)要的綜述。

1 常規(guī)疫苗

臨床上常用的豬乙型腦炎疫苗有鼠腦滅活苗和減毒活疫苗兩種，現(xiàn)分別簡(jiǎn)述如下:

1．1 滅活疫苗 鼠腦滅活疫苗于上世紀(jì)50年代在日本研究成功，是當(dāng)前惟一獲得世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)并用于商品化出售的人用乙型腦炎疫苗。目前鼠腦滅活苗已經(jīng)準(zhǔn)許在中國(guó)、日本、印度、朝鮮、韓國(guó)、泰國(guó)等地生產(chǎn)和使用，其中美國(guó)、加拿大等國(guó)家使用的是日本BIKEN公司生產(chǎn)商品名為JEVAX［2］。泰國(guó)、印度、越南、朝鮮和馬來(lái)西亞等乙型腦炎高度流行的國(guó)家使用該疫苗后，有效的降低了乙型腦炎的感染率［3］。鼠腦滅活疫苗免疫效果確實(shí)，且安全可靠。

我國(guó)最早研制成功的豬乙型腦炎疫苗即為鼠腦滅活疫苗，1996年獲得新獸藥注冊(cè)證書，研制單位是湖北省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所。該單位從流產(chǎn)胎豬腦內(nèi)分離出的一株豬乙型腦炎強(qiáng)毒W(wǎng)H－1株，腦內(nèi)接種7～9 g的小鼠，收獲發(fā)病小鼠的腦組織，過濾、滅活、乳化等工藝制成疫苗。該疫苗對(duì)各類豬群，尤其是對(duì)青年妊娠母豬和公豬的安全性好，免疫接種后無(wú)異常反應(yīng)，無(wú)病毒血癥及胎內(nèi)感染，對(duì)豬乙型腦炎引起母豬繁殖障礙保護(hù)率高［4］。

1．2 減毒活疫苗 豬乙型腦炎減毒活疫苗是湖北省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所研制。生產(chǎn)毒株SA14－14－2由中國(guó)藥品生物制品檢定所采用分離自蚊幼蟲的SA14株乙型腦炎病毒進(jìn)行傳代、噬斑篩選得到［5］。用該毒株接種地鼠腎原代細(xì)胞培養(yǎng)，收獲病毒培養(yǎng)液，加適宜的穩(wěn)定劑，經(jīng)冷凍真空干燥制成疫苗。該減毒活疫苗具有可靠的安全性、良好的免疫原性。用后備母豬進(jìn)行免疫原性試驗(yàn)，能產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答;免疫該疫苗的初產(chǎn)母豬能抵抗JEV強(qiáng)毒的攻擊，不產(chǎn)生病毒血癥，對(duì)胎兒感染的保護(hù)率達(dá)100%［6］。該疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)收錄入2010版《中國(guó)獸藥典》。但由于地鼠腎原代細(xì)胞基質(zhì)無(wú)法獲得WHO的認(rèn)證，此種疫苗尚未在國(guó)際上使用。

2 新型疫苗

盡管上述兩種常規(guī)疫苗在豬乙型腦炎的防控中發(fā)揮了重要作用，但鼠腦滅活疫苗生產(chǎn)成本相對(duì)較高，減毒活疫苗本身存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)，人們有必要開發(fā)新型豬乙型腦炎疫苗。

2．1 重組活載體疫苗 乙型腦炎病毒和豬瘟病毒屬于黃病毒科的成員，其基因結(jié)構(gòu)具有一定的同源性，因此可以通過反向遺傳學(xué)技術(shù)將其中一種病毒結(jié)構(gòu)蛋白的基因替換另一種病毒的結(jié)構(gòu)基于構(gòu)建嵌合病毒。Yang Z等［7］將截短的JEV E基因代替豬瘟病毒的E基因，構(gòu)建了反向互補(bǔ)的乙型腦炎－豬瘟嵌合復(fù)制子病毒顆粒(CSF－JE virus replicon particle，CSF－JE VRP)。用 CSF－JE VRP免疫小鼠后能夠誘導(dǎo)乙型腦炎特異性抗體，并能抵抗JEV強(qiáng)毒的攻擊;免疫豬后能夠同時(shí)誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗乙型腦炎和豬瘟病毒的抗體，為開展豬乙型腦炎豬瘟二聯(lián)基因工程疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

賽諾菲巴斯德公司以黃病毒17D株為載體，用乙型腦炎病毒SA14－14－2株prM和E基因代替黃病毒17D的prM和E基因，構(gòu)建成功了黃熱乙型腦炎嵌合病毒。三期臨床證明，其安全性與接種安慰劑組相當(dāng)，而優(yōu)于鼠腦滅活疫苗，一次單劑量接種血清抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率為99．1%［8］。該疫苗已經(jīng)在澳大利亞注冊(cè)成功［9］。此外，還有用痘病毒和偽狂犬病毒作為載體的，但均處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。

2．2 亞單位疫苗 JEV E基因具有良好的免疫原性，是基因工程疫苗研究的首選靶蛋白。Xu XG等［10］構(gòu)建重組桿狀病毒表達(dá)JEV E蛋白，用表達(dá)的蛋白免疫小鼠和豬，可以誘導(dǎo)JE特異性中和抗體，保護(hù)小鼠和豬免受JEV的攻擊。

乙型腦炎病毒樣顆粒疫苗在生產(chǎn)過程中可避免乙型腦炎病毒的操作，避免了生物安全隱患，又具有良好的免疫原性，是一種較理想的疫苗形式。JEV結(jié)構(gòu)蛋白(prM/M和E)在載體病毒感染或由表達(dá)M、E蛋白的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)物中可以自身裝配成病毒樣顆粒。Kojima等［11］構(gòu)建了基于Beijing－1毒株的prM－E蛋白編碼基因的真核表達(dá)載體，篩選穩(wěn)定表達(dá)E蛋白的細(xì)胞克隆，將表達(dá)的E蛋白免疫小鼠，7個(gè)月后仍保持高滴度的中和抗體，用JEV強(qiáng)毒對(duì)小鼠進(jìn)行攻擊后，保護(hù)率為100%，使得病毒樣顆粒成為乙型腦炎疫苗研究的重要思路。

2．3 DNA疫苗 DNA疫苗是將抗原基因重組到真核表達(dá)載體，注入體內(nèi)表達(dá)出相應(yīng)抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。Konishi E構(gòu)建了兩株基于prM和E基因的DNA疫苗，以100～450μg劑量間隔3周對(duì)豬進(jìn)行二次免疫。二疫后第1周即產(chǎn)生1∶40～1∶160的中和抗體和血凝抑制抗體，而且高水平的血凝抑制抗體能夠維持 245 d［12］。Zhang Y 等［13］又發(fā)現(xiàn)對(duì)E蛋白的N154糖基化位點(diǎn)進(jìn)行突變后，能夠增強(qiáng)該DNA疫苗對(duì)小鼠誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)。

3 豬乙型腦炎疫苗的發(fā)展方向

3．1 開展組織細(xì)胞培養(yǎng)豬乙型腦炎疫苗的研究

鼠腦滅活苗是由鼠腦組織制備的，疫苗的生產(chǎn)必須經(jīng)過每只小鼠的腦內(nèi)接種，感染鼠腦的收獲，操作過程繁瑣，難以形成工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模。隨著地鼠腎細(xì)胞苗的誕生，標(biāo)志乙型腦炎疫苗由組織苗向細(xì)胞苗發(fā)展，SA14－14－2株活疫苗生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，但是原代地鼠腎細(xì)胞難以杜絕外源因子的污染。為此，人們又采用傳代細(xì)胞Vero細(xì)胞為基質(zhì)制備疫苗，Vero細(xì)胞具有胞核學(xué)穩(wěn)定，沒有外源因子污染和致瘤性，而且研究表明，乙型腦炎病毒對(duì)Vero細(xì)胞比較敏感，不需要傳代適應(yīng)，P3株10代以內(nèi)免疫原性不會(huì)降低［14］。目前Vero細(xì)胞人用乙型腦炎滅活苗已經(jīng)在美國(guó)、加拿大、以色列、中國(guó)等多個(gè)國(guó)家注冊(cè)使用［15］?？梢哉f人用乙型腦炎疫苗的發(fā)展經(jīng)歷了動(dòng)物組織苗、原代細(xì)胞苗和傳代細(xì)胞苗的發(fā)展歷程。豬乙型腦炎疫苗的生產(chǎn)還處于組織苗和原代細(xì)胞苗的階段。隨著豬乙型腦炎防控的需要，豬乙型腦炎組織細(xì)胞培養(yǎng)疫苗的研究也會(huì)越來(lái)越被人們所重視。目前我公司在現(xiàn)有的鼠腦滅活苗的基礎(chǔ)上，正積極開展豬乙型腦炎Vero細(xì)胞滅活疫苗的研究，期望在不久的將來(lái)為我國(guó)豬乙型腦炎的防控提供一種新型疫苗。

3．2 開展豬乙型腦炎基因工程疫苗的研究 基因工程疫苗是當(dāng)前分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)發(fā)展的產(chǎn)物，包括DNA疫苗、重組活載體疫苗、基因工程亞單位疫苗等，是獸用疫苗發(fā)展的一個(gè)重要方向。目前已有數(shù)個(gè)產(chǎn)品在田間應(yīng)用，如禽流感－新城疫重組二聯(lián)活疫苗(rL－H5株)［16］;雞傳染性法氏囊病病毒火雞皰疹病毒載體活疫苗(vHVT－013－69株)［17］等。在豬乙型腦炎疫苗的研究方面，盡管人們?cè)谥亟M活載體疫苗［7］、DNA 疫苗［12－13］等方面做了很多的基礎(chǔ)性的工作，但均處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，應(yīng)用到臨床還有大量的工作要做。隨著對(duì)豬乙型腦炎致病機(jī)制研究的深入，研制豬乙型腦炎基因工程疫苗將成為預(yù)防豬乙型腦炎重要的發(fā)展方向。

3．3 開展豬乙型腦炎疫苗新生產(chǎn)工藝研究 疫苗的生產(chǎn)工藝是決定疫苗安全性、質(zhì)量穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。乙型腦炎疫苗的發(fā)展也伴隨著生產(chǎn)技術(shù)的提升，也是疫苗有效性、安全性、穩(wěn)定性不斷提升的過程。鼠腦滅活苗產(chǎn)量有限，疫苗的生產(chǎn)屬于純手工操作，工業(yè)化生產(chǎn)受到限制。而Vero細(xì)胞作為傳代細(xì)胞，適合于大規(guī)模高密度培養(yǎng)。Keishin Sugawara等采用生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)，建立了500L的Vero細(xì)胞乙型腦炎滅活疫苗生產(chǎn)體系［18］，真正實(shí)現(xiàn)了生產(chǎn)的工業(yè)化自動(dòng)化控制?？梢灶A(yù)見的是生物反應(yīng)器微載體生產(chǎn)工藝將會(huì)逐漸成為主流生產(chǎn)工藝，替代手工操作的生產(chǎn)工藝。

粗制疫苗含有異源蛋白和亞細(xì)胞成分，免疫后會(huì)引起副反應(yīng)，而濃縮純化抗原可以提高疫苗免疫效果、降低副反應(yīng)。為此，人用乙型腦炎疫苗采用了抗原的超濾濃縮純化工藝，并將牛血清白蛋白殘留量、宿主細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)殘留量納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［19］。目前豬乙型腦炎疫苗均為粗制疫苗，純化工藝還沒有被應(yīng)用。但隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，高品質(zhì)純化疫苗會(huì)有更多市場(chǎng)需求，純化工藝研究和應(yīng)用會(huì)越來(lái)越來(lái)普遍。

4 結(jié)語(yǔ)

盡管豬乙型腦炎疫苗的研究已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，但目前用于臨床的還是鼠腦滅活疫苗和減毒活疫苗兩種傳統(tǒng)疫苗。相信隨著對(duì)豬乙型腦炎研究的深入，人們終將研究出更為安全、有效、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的豬乙型腦炎疫苗。

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