王 琴，范學(xué)政，趙啟祖，徐 璐

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

豬瘟又稱經(jīng)典豬瘟(Classical swine fever，CSF)，是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起豬的高度致死性、接觸性傳染病，是嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病。近10年來，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所在豬瘟的流行病學(xué)、信息系統(tǒng)的建立、診斷系列新技術(shù)研發(fā)、疫苗效檢替代方法、致病機(jī)制及標(biāo)記疫苗的研究以及豬瘟的防控與凈化方面所取得了突破性進(jìn)展，現(xiàn)綜述如下。

1 我國豬瘟病毒分子流行病學(xué)及信息系統(tǒng)的研究

CSF分子流行病學(xué)調(diào)查研究對闡明CSFV的遺傳變異特征和規(guī)律，掌握當(dāng)前的流行現(xiàn)狀，溯源和追蹤C(jī)SF疫情發(fā)生的來源和去向，監(jiān)測現(xiàn)行使用疫苗的有效性，建立分子流行病學(xué)監(jiān)測系統(tǒng)，提出新的防制策略具有十分重要的科學(xué)意義。

國際上將CSFV分為3個基因群(Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群)，10 個基因亞群(1.1、1.2、1.3、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2、3.3 和 3.4)［1］。為弄清我國 CSF 流行病學(xué)本底，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和軍事獸醫(yī)研究所分析了我國31個省市自治區(qū)自1979到2010年間的554條E2基因序列，表明我國流行毒株均為4個基因亞群(2.1、2.2、2.3 和1.1)，以基因 2 群(73.82%)為主，其次是 1 群(26.18%)。一直沒有監(jiān)測到基因3群的傳入與流行，但在周邊國家和地區(qū)如韓國、泰國、臺灣等均有基因3群，應(yīng)嚴(yán)密加強(qiáng)監(jiān)測［2］。多年一些學(xué)者認(rèn)為流行毒株免疫基因正在朝著遠(yuǎn)離疫苗的方向變異，導(dǎo)致免疫失敗，對上述從1979-2010年流行毒株與疫苗株E2基因核苷酸同源性進(jìn)行逐年分析，發(fā)現(xiàn)疫苗毒株抗原基因與流行株同源性在2007年最低，為76.2%，疫苗免疫保護(hù)試驗(yàn)也證實(shí)了我國目前使用的疫苗對同源性在76.2%以上的流行毒株攻擊依然有效［3］。中監(jiān)所曾用不同時間、不同地點(diǎn)、不同基因亞群和不同致病力的野毒株進(jìn)行單獨(dú)、混合、一次、多次或交叉攻毒，結(jié)果接種豬均能得到完全保護(hù)［4］。為此在我國使用HCLV進(jìn)行高密度(100%)強(qiáng)制免疫，仍然是有效的政策，筆者建議在今后的監(jiān)測工作中，如發(fā)現(xiàn)流行毒株與疫苗株E2基因同源性低于76.2%時，應(yīng)及時進(jìn)行免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)并監(jiān)測疫苗的有效性。國際上對CSFV的分子流行病學(xué)研究，以位于德國漢諾威(Hannover)的歐盟CSF參考實(shí)驗(yàn)室研究數(shù)據(jù)最為完善，該實(shí)驗(yàn)室收集了來自35個國家E2基因數(shù)據(jù)已經(jīng)接近1000條。我國經(jīng)過多年的CSFV分子流行病學(xué)調(diào)查研究，弄清了中國CSFV的遺傳衍化背景，填補(bǔ)了國際上CSFV分子流行病學(xué)研究缺乏中國數(shù)據(jù)這一空白，表明我國CSFV遺傳變異情況在32年間處于穩(wěn)定狀態(tài)。通過調(diào)用歐盟CSF參考實(shí)驗(yàn)室的部分基因數(shù)據(jù)，有助于分析我國豬瘟流行病學(xué)數(shù)據(jù)，為防治提供依據(jù)。我國養(yǎng)豬模式多樣，生態(tài)環(huán)境多樣，繼續(xù)開展不間斷的分子流行病學(xué)跟蹤調(diào)查，實(shí)時跟蹤病毒變異特征及抗原性變異程度，監(jiān)測新的流行毒株的情況和疫苗對流行毒株的有效性，不僅對我國CSF防制具有重要的指導(dǎo)意義，對建立該病毒的全球監(jiān)測體系具有深遠(yuǎn)意義。

中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所聯(lián)合軍事獸醫(yī)研究所、中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心將CSF流行病學(xué)信息數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫技術(shù)、GIS技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)相結(jié)合。采用ArcGIS桌面產(chǎn)品、ArcMapObjects軟件和Delphi軟件，在中國數(shù)字地圖的數(shù)據(jù)支持下，創(chuàng)新性的建立了CSF流行病學(xué)信息系統(tǒng)(CSFinfo)，使我們成為全球繼德國之后第二個有這種數(shù)據(jù)庫的國家［5］。CSFinfo對加強(qiáng)CSF流行病學(xué)信息的統(tǒng)一管理，掌握全球CSF數(shù)據(jù)，分析CSF傳播來源，建立一整套連續(xù)、可靠、完整、系統(tǒng)的國內(nèi)外CSF流行病學(xué)資料，對我國CSF防控具有十分重要的意義。

2 豬瘟病毒致病機(jī)制

CSFV的3’UTR被認(rèn)為與病毒基因組的復(fù)制、翻譯以及復(fù)制和翻譯的調(diào)控有關(guān)，序列比對發(fā)現(xiàn)HCLV的3’UTR核苷酸的第61位有一個12-nt(CUUUUUUCUUUU)的插入序列，而在強(qiáng)毒SM株以及其它毒株中缺失。為研究這一特征性序列的生物學(xué)功能，構(gòu)建兩個突變株感染性cDNA克隆，一株是在強(qiáng)毒SM株基因組pT7SM感染性cDNA克隆 3’UTR的第 61位處插入了 12個堿基“CTTTTTTCTTTT”;另一個是 pT7SM 的3’UTR完全被HCLV基因組3’UTR所替換。結(jié)果兩個突變株在PK-15細(xì)胞上的增殖滴度比其親本株下降了約100倍，對實(shí)驗(yàn)用豬產(chǎn)生了明顯減毒的現(xiàn)象，有效誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體并使宿主完全抵抗致死劑量SM強(qiáng)毒的攻擊，與HCLV十分類似。表明HCLV 3’UTR的12個堿基插入對CSFV復(fù)制和毒力有著重要影響，與疫苗減毒有重要關(guān)系。該結(jié)果也提示CSFV的非編碼區(qū)突變可以影響病毒的毒力，這對理解CSFV的減毒機(jī)理以及開發(fā)新一代疫苗提供理論依據(jù)［6］。

3 豬瘟診斷新技術(shù)

CSF的診斷多年來一直困擾著對該病的凈化策略，近年我國CSF診斷技術(shù)取得突破性進(jìn)展。病原分子診斷技術(shù)已經(jīng)達(dá)到國際水平，同時建立了抗體阻斷ELISA方法和抗體間接ELISA方法。

3.1 病原學(xué)診斷技術(shù) 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和軍事獸醫(yī)研究所CSFV通用熒光RT-PCR試劑盒的建立，可對所有CSFV進(jìn)行檢測，該方法十分成熟和穩(wěn)定，獲國家專利(200610109404.X)并形成國標(biāo)(GB/T27540-2011)，特別對非典型、溫和型及持續(xù)感染CSF的診斷提供一個快速、敏感、準(zhǔn)確的方法，是適用于種豬凈化的可靠手段。我國CSF免疫采取的是100%強(qiáng)制免疫措施，建立快速、敏感、特異地檢測CSFV野毒的方法十分必要，CSFV MGB鑒別熒光RT-PCR方法的研制，為臨床鑒別野毒和疫苗毒提供了可靠的工具，該方法獲國家專利(CN2010242080.0)。歐盟CSF參考試驗(yàn)室根據(jù)已知毒株的基因序列，鎖定主要保護(hù)性抗原E2基因區(qū)域的2467～2738之間共272bp的片段作為序列測定和分析目標(biāo)，能反應(yīng)不同毒株抗原基因序列的變化特點(diǎn)，是用于毒株間系統(tǒng)發(fā)生分析的首選公認(rèn)區(qū)域［1］。本課題組對其改進(jìn)優(yōu)化，并進(jìn)行了12年的臨床應(yīng)用，該方法不僅可用于核酸的檢測和診斷，采用其擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序用于CSFV分子流行病學(xué)研究，達(dá)到了一舉兩得的目的［7］。

CSFV抗體標(biāo)記技術(shù)有免疫熒光技術(shù)和過氧化物酶標(biāo)記技術(shù)，也是OIE推薦的CSF病原檢測技術(shù)之一。采用從英國AHVLA實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)的CSFV E2單抗WH303作為一抗，標(biāo)記辣根過氧化酶的兔抗鼠二抗，建立了免疫過氧化物酶細(xì)胞單層試驗(yàn)染色方法，用于CSFV TCID50檢測、疫苗定量、病毒分離鑒定、拯救重組CSFV的鑒定［8-9］，具有很好的特異性和準(zhǔn)確性。直接對單抗WH303進(jìn)行熒光素標(biāo)記，制成熒光特異性抗體，直接與細(xì)胞或組織中相應(yīng)蛋白抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光。我所和軍事獸醫(yī)研究所采用該單抗(WH303)分別建立了CSFV免疫熒光試驗(yàn)和CSFV間接免疫熒光試驗(yàn)，較多抗標(biāo)記法更特異和準(zhǔn)確，容易分辨，錯判誤判率會大大減少，田間推廣應(yīng)用容易，是CSF凈化的一項準(zhǔn)確、特異和簡便的技術(shù)。

3.2 抗體檢測技術(shù) CSF抗體水平檢測是疫苗免疫效果評價的主要方法，ELISA方法以其操作簡便、敏感、檢測樣本量大等優(yōu)點(diǎn)成為其主要手段，研發(fā)國產(chǎn)化的準(zhǔn)確度高的CSF抗體ELISA檢測試劑盒勢在必行。本實(shí)驗(yàn)室采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得CSFVE2基因可溶性表達(dá)產(chǎn)物(CN200810223406.0)，突破了診斷用抗原的關(guān)鍵制備技術(shù);對單抗WH303進(jìn)行純化和FITC標(biāo)記，分別建立了 CSF間接ELISA方法和阻斷ELISA方法［10］。

抗體間接ELISA方法:采用中和實(shí)驗(yàn)作為金標(biāo)準(zhǔn)與間接ELISA對232個陽性樣本和242個陰性樣本進(jìn)行符合實(shí)驗(yàn)，其敏感性符合率為90.95% ，特異性符合率為94.21%，兩種方法的總符合率為92.62%。該方法具有操作簡便，靈敏度高等特點(diǎn)，通過對血清中E2蛋白多抗的檢測，可全面反應(yīng)豬體內(nèi)抗體水平，適用于田間大規(guī)模免疫抗體水平普查、商品豬場免疫效果評價和不同免疫水平豬群的分群。

抗體阻斷ELISA檢測方法，對PRRSV、PRV、PCV、PPV、BVDV等病毒性疾病抗體(CSF抗體為陰性)無交叉反應(yīng)。對285份臨床血清樣本的檢測結(jié)果表明，與IDEXX試劑盒的特異性為94.2%，敏感性為98%，兩種方法的符合性為97.5%。由于采用單抗WH303作為酶標(biāo)抗體，大大了降低非特異性反應(yīng)。該方法除用于田間大規(guī)模普查外，尤其適用于規(guī)?；N豬場和重點(diǎn)疫區(qū)抗體監(jiān)測。制備成本較低，穩(wěn)定性好，為我國CSF抗體水平的監(jiān)測提供了重要的技術(shù)支持。

3.3 豬瘟兔化弱毒疫苗效檢替代方法的建立 豬瘟兔化弱毒株是世界公認(rèn)的最安全、免疫效果最好的疫苗毒株，也是我國唯一使用的豬瘟疫苗毒株。由于家兔個體差異和標(biāo)準(zhǔn)化程度不高、檢測周期長有關(guān)，無疑提高了疫苗儲藏成本，因此家兔熱反應(yīng)對疫苗效力檢驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，建立新的準(zhǔn)確簡便的替代方法，提高疫苗檢測質(zhì)量，對其質(zhì)量監(jiān)控至關(guān)重要。我們建立的HCLV熒光定量PCR方法和單抗WH303直接免疫熒光檢測方法與兔熱反應(yīng)比較，三者之間存在良好相關(guān)性，對CT值在17.10～20.81，病毒含量在8.27 ×104～1.11 ×106copy/μL，TCID50值在 10-2.88/0.1 ～10-4.54/0.1 mL 之間的疫苗半成品原液，可以按半成品疫苗原液每毫升能引起100萬個兔體定型熱反應(yīng)進(jìn)行配苗［11］。為疫苗效檢提供了一種快速、敏感、特異的方法，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的兔熱反應(yīng)方法，更準(zhǔn)確、快速指導(dǎo)疫苗的生產(chǎn)，縮短生產(chǎn)周期，產(chǎn)生更明顯的經(jīng)濟(jì)和社會效益。

應(yīng)歐盟CSF參考實(shí)驗(yàn)室邀請，中監(jiān)所從2009到2011年連續(xù)3年參加歐盟CSF參考實(shí)驗(yàn)室組織的來自42個國家50個實(shí)驗(yàn)室的CSF診斷比對實(shí)驗(yàn)。采用了本實(shí)驗(yàn)室建立的CSFV通用熒光RT-PCR方法、CSFV鑒別熒光MGB-RT-PCR方法和CSFV RT-nPCR方法，病原檢測結(jié)果與歐盟完全一致;采用本實(shí)驗(yàn)室建立的CSF抗體間接ELISA和阻斷ELISA方法，僅間接ELISA對一個盲樣反應(yīng)結(jié)果為陰性或可疑，其余樣本完全符合。3次國際比對、國內(nèi)比對以及我們的大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中監(jiān)所研制的系列方法彌補(bǔ)了我國CSF病原檢測的空白，組裝的CSF病原檢測試劑盒相關(guān)指標(biāo)達(dá)到歐盟參考實(shí)驗(yàn)室技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，抗體檢測試劑盒相關(guān)指標(biāo)達(dá)到了進(jìn)口商品化試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)。可實(shí)現(xiàn)CSF病原檢測和CSF抗體檢測試劑盒的國產(chǎn)化，提升我國CSF診斷水平，為獲得國際貿(mào)易認(rèn)可鋪平了道路，具有很好的推廣應(yīng)用前景和極大的產(chǎn)業(yè)化價值。

通過和歐洲的交流及合作，提升了科技創(chuàng)新能力，解決CSF準(zhǔn)確診斷的關(guān)鍵問題，建立了良好的國際合作渠道，提升了該實(shí)驗(yàn)室的國際地位，建立并完善我國系列CSF診斷技術(shù)，進(jìn)而改進(jìn)和完善我國CSF預(yù)防控制策略。至此，我們在CSF診斷、疫情監(jiān)測、分子流行病學(xué)調(diào)查分析等所需的檢測方法已經(jīng)系統(tǒng)建立，已經(jīng)成為國內(nèi)建立和掌握CSF診斷技術(shù)最全的實(shí)驗(yàn)室之一。

4 標(biāo)記疫苗的研究

由于HCLV接種豬與自然感染豬不能從血清學(xué)上予以區(qū)分，我國CSF防控實(shí)行的是強(qiáng)制免疫措施，開發(fā)CSF標(biāo)記活疫苗對于我國CSF凈化和參與國際貿(mào)易具有現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用反向遺傳操作技術(shù)，在C株感染性克隆的E1 C末端插入FLAG基因作為標(biāo)記分子，構(gòu)建了含有FLAG標(biāo)記的vC-FLAG病毒。細(xì)胞適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)證明vC-FLAG病毒可以適應(yīng)多種豬源細(xì)胞，SK6細(xì)胞系是培養(yǎng)vC-FLAG的最適細(xì)胞系。不同代次病毒經(jīng)免疫組化、RT-PCR和核苷酸序列測定證明嵌合病毒能穩(wěn)定表達(dá)標(biāo)記抗原，且在細(xì)胞中傳代的遺傳穩(wěn)定性良好，為CSF標(biāo)記疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。

5 豬瘟凈化策略研究

CSF是我國政府計劃要根除的重要傳染病，通過“十一五”支撐計劃《豬瘟、豬偽狂犬病綜合防空集成與示范》的實(shí)施，集成上述技術(shù)，按照準(zhǔn)備階段→控制階段→強(qiáng)制凈化階段→監(jiān)測階段→認(rèn)證階段等五個凈化程序，通過對CSF快速診斷試劑盒、疫苗毒株和致病毒株鑒別診斷方法的篩選和整合，免疫程序的調(diào)整，生物安全措施的綜合實(shí)施。對CSF嚴(yán)重污染場，CSF病原陽性率分別從2006年的7.08% ～11.49%下降至 2010年的0% ～2.07%，達(dá)到基本清除CSF的目標(biāo);對CSF一般污染場，陽性率分別從0.87% ～3.09%下降至0%，清除CSF。CSF免疫合格率總體上升，從2006年的67.30% ～90.67%上升至2010年的 85.00% ～96.32%。達(dá)到了基本無疫或無疫，成功在15個規(guī)模化養(yǎng)豬示范場使7個場凈化了CSF，示范場生產(chǎn)指標(biāo)得到了全面改善，經(jīng)濟(jì)效益穩(wěn)步提升，提升了養(yǎng)豬場的理論水平和疫病防控能力。構(gòu)建了符合我國國情的規(guī)模化豬場CSF和豬偽狂犬病的不同凈化模式，形成了一系列的指導(dǎo)方案，制定了《規(guī)?；i場豬瘟、豬偽狂犬病綜合防控技術(shù)集成與示范實(shí)施方案》、《規(guī)模化豬場豬瘟凈化技術(shù)指南》、《集約化、規(guī)模化豬場生物安全體系的實(shí)施方案》和《“豬瘟、豬偽狂犬病綜合防控技術(shù)集成與示范”課題種豬凈化認(rèn)證方案建議》等指南，取得的重要創(chuàng)新性成果，可用于指導(dǎo)我國CSF的防控和凈化。

CSF困擾我國養(yǎng)豬業(yè)已經(jīng)半個多世紀(jì)，目前依然是各級政府計劃要根除的重大豬病。上述研究表明CSF的病毒基因組比較穩(wěn)定，且只有一個血清型，對該病毒的清除是一個有利條件。同時本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的診斷技術(shù)已經(jīng)達(dá)到國際技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，并被國際上認(rèn)可。尤其是“十一五”期間對我國部分養(yǎng)豬場凈化CSF的成功先例表明，在我國目前豬病流行狀態(tài)下，在規(guī)?；i場和部分區(qū)域開展CSF的凈化是完全可行的。

致 謝: 感謝軍事獸醫(yī)研究所涂長春教授，中國動物與衛(wèi)生流行病學(xué)中心黃保續(xù)教授及英國AHVLA Trevor Drew教授給予的幫助。

［1］Paton D J，McGoldrick A，Greiser-Wilke I，et al.Genetic typing of classical swine fever virus［J］.Vet Microbiol，2000，73:137-157.

［2］Tu C，Lu Z，Li H，et al.Phylogenetic comparison of classical swine fever virus in China［J］.Virus Res，2000，81:29-37.

［3］趙 耘，王在時，王 琴，等.23株豬瘟病毒E2基因主要抗原編碼區(qū)序列差異分析［J］.中國獸醫(yī)科技，2002，3:3-5.

［4］丘惠深，郎洪武，王在時.豬瘟兔化弱毒疫苗與我國近年豬瘟野毒的免疫保護(hù)相關(guān)性試驗(yàn)［J］.中國獸藥雜志，1997，(3):3-5.

［5］王 琴，涂長春，黃保續(xù)，等.豬瘟流行病學(xué)信息系統(tǒng)(CSF info)的建立及應(yīng)用［C］.中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2006學(xué)術(shù)年會論文集，2006:228-231.

［6］Wang Y，Wang Q，Lu X，et al.12-nt insertion in 3’untranslated region leads to attenuation of classic swine fever virus and protects host against lethal challenge［J］.Virology，2008，374:390-398.

［7］ 湯 波.豬瘟病毒E2基因RT-PCR檢測方法的建立及病毒分子流行病學(xué)研究［D］.西南大學(xué)，2009.

［8］范運(yùn)峰，趙啟祖，趙 耘，等.豬瘟病毒低溫誘變疫苗Thiverval株感染性克隆的構(gòu)建及病毒拯救［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2009，9:1420-1425.

［9］范運(yùn)峰，趙啟祖，趙 耘，等.從全長cDNA克隆恢復(fù)豬瘟病毒方法的研究［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2009，6:56-60.

［10］熊丁杰.豬瘟抗體阻斷ELISA檢測方法的建立和對豬瘟活疫苗免疫效果的評價［D］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［11］姚華偉.豬瘟兔化弱毒疫苗效檢替代方法及疫苗中牛病毒性腹瀉病毒檢測方法的研究［D］.西南大學(xué)，2011.