程肖蕊，周文霞，張永祥

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所中藥和神經(jīng)免疫藥理研究室，北京 100850)

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(Network pharmacology)是從系統(tǒng)生物學(xué)和生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度闡釋疾病的發(fā)生發(fā)展過程、從改善或恢復(fù)生物網(wǎng)絡(luò)平衡的整體觀角度認(rèn)識藥物與機體的相互作用并指導(dǎo)新藥發(fā)現(xiàn)。因此，它是在高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、計算機模擬計算及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索的基礎(chǔ)上，進行生物網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析，進而進行藥物作用機制的研究及創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)［1－2］。目前，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)一方面受限于現(xiàn)有實驗數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫的完整性和準(zhǔn)確性［3］，另一方面很難對基于網(wǎng)絡(luò)所建立的預(yù)測模型(如靶點組合、通路組合、子網(wǎng)組合、藥物組合或多靶點藥物等)進行驗證或鑒定，因此，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展依賴于實驗新技術(shù)新方法的發(fā)展和突破。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路通?？煞譃?類:一是根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫和公開發(fā)表的已有數(shù)據(jù)，建立特定藥物作用機制網(wǎng)絡(luò)預(yù)測模型，預(yù)測藥物作用靶點/機制，從生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度解析藥物作用的藥理學(xué)機制。如有研究者在闡釋抗糖尿病中藥復(fù)方糖敏靈作用機制的基礎(chǔ)上，采用虛擬篩選和網(wǎng)絡(luò)預(yù)測的手段對Rheidin A、Rheidin C、番瀉苷C(sennoside C)、原花青素C1(procyanidin C1)和二氫哈爾滿(Dihydrobaicalin)這幾種從未報導(dǎo)過具有抗2型糖尿病作用的成分進行預(yù)測就采用了上述思路［4］;同樣對麻黃湯(herba ephedrae decoction，HED)新藥理作用進行的預(yù)測［5］也采用了上述思路。二是利用各種組學(xué)技術(shù)以及高內(nèi)涵/高通量技術(shù)，觀察藥物對模型(分子、細(xì)胞、組織或/和動物)的作用或模型對藥物的作用，針對所產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)的手段分析和構(gòu)建藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，建立預(yù)測模型，進而解析所研究藥物的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機制。當(dāng)然，這兩個思路也可并行發(fā)展、綜合分析，如有些對丹酚酸B治療心血管疾病的作用進行系統(tǒng)研究即采用了此思路［6］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中與實驗相關(guān)的環(huán)節(jié)有兩個:一是基于實驗結(jié)果構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)所需基本數(shù)據(jù)的獲取，另一個是對所建立的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測模型進行實驗驗證，這兩個環(huán)節(jié)涉及的技術(shù)均應(yīng)具有可高通量、定量、快速、靈敏、簡便、可靠地獲取大量數(shù)據(jù)的特點，這樣才能滿足網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)建立在海量數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上的研究要求。綜合近年來生命科學(xué)研究領(lǐng)域技術(shù)方法的進展，目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究在實驗研究水平所涉及的相關(guān)技術(shù)除了組學(xué)(基因組、蛋白質(zhì)組、代謝組和糖組等)技術(shù)外，主要包括3個方面:高通量/高內(nèi)涵技術(shù)、雙高通量基因表達(dá)檢測技術(shù)和分子相互作用技術(shù)。

1 高通量/高內(nèi)涵技術(shù)

高通量(high though-put assay，HTS)/高內(nèi)涵技術(shù)(high content assay，HCS)是指在保持細(xì)胞、組織或整體動物結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下，一次性檢測成百上千個處理且同時檢測被篩樣品對活細(xì)胞、組織或整體動物多個表型的作用，如形態(tài)、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)各個環(huán)節(jié)等。其特點是可在單一實驗中獲取大量相關(guān)信息，可應(yīng)用高分辨率的熒光數(shù)碼影像系統(tǒng)和后續(xù)的自動數(shù)字圖像分析、處理、儲存技術(shù)進行高度整合，具有均質(zhì)、多維表型檢測、實時動態(tài)監(jiān)測和可視化的特點。因此，這種具有多維表型檢測的HTS/HCS技術(shù)［7－9］適合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究需要海量、準(zhǔn)確數(shù)據(jù)的要求。

1.1 基于細(xì)胞的高通量/高內(nèi)涵技術(shù)

高通量/高內(nèi)涵技術(shù)在細(xì)胞模型上是應(yīng)用最為成熟的，它通過自動顯微攝影和圖像自動分析，全景式準(zhǔn)確、快速、目標(biāo)導(dǎo)向性的定量檢測細(xì)胞包括復(fù)雜的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)和生化特性在內(nèi)的各種表型。如其應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)可定量樹突的各個指標(biāo)、蛋白聚集、轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位、神經(jīng)遞質(zhì)受體內(nèi)化、神經(jīng)元和突觸數(shù)量、細(xì)胞遷移和分化及凋亡等。這種在細(xì)胞模型上的高通量/高內(nèi)涵技術(shù)結(jié)合組學(xué)技術(shù)所產(chǎn)生的結(jié)果，可為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建提供無偏、準(zhǔn)確的基本數(shù)據(jù)，并對網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中基序(motif)和功能模塊(module)的確定提供信息。

在基于細(xì)胞模型的高通量/高內(nèi)涵技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的是報告基因技術(shù)。它使連接有靶基因的報告基因能在細(xì)胞中表達(dá)，并能通過報告基因的表達(dá)變化反映靶基因表達(dá)的激活或抑制。目前主要使用的報告基因為外源性熒光蛋白或熒光素酶，通過熒光或發(fā)光的方法檢測報告基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物變化，可靈敏地反映細(xì)胞內(nèi)某種特定生化或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變等。例如，對防治阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的重要靶點γ-分泌酶活性研究即可采用該方法［10］。γ-分泌酶裂解淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)胞內(nèi)段產(chǎn)生 β － 淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)、Notch和其他細(xì)胞底物，研究中可將膜結(jié)合的熒光探針綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)(即報告基因)連接在γ-分泌酶的底物APP或APP的C99片段上，使APP-GFP/APP-C99-GFP在細(xì)胞中表達(dá)，若γ-分泌酶有活性時就切割帶有標(biāo)簽的底物，熒光從質(zhì)膜轉(zhuǎn)向胞質(zhì)，那么利用高內(nèi)涵儀器檢測質(zhì)膜與胞質(zhì)熒光強度的比值即可檢測細(xì)胞γ-分泌酶的活性，也可將細(xì)胞通透洗去胞質(zhì)中熒光后，使用流式細(xì)胞儀檢測質(zhì)膜熒光的剩余量而評價γ-分泌酶活性，進而可用于篩選和評價 γ-分泌酶調(diào)節(jié)劑［11］。

此外，目前不依賴于報告基因技術(shù)，而基于免疫熒光技術(shù)的高通量、全景式檢測細(xì)胞表型的高內(nèi)涵技術(shù)也得到了長足的發(fā)展和應(yīng)用。如在培養(yǎng)的大鼠原代皮層細(xì)胞，可同時使用微管蛋白(tubulin)一抗配合FITC標(biāo)記的二抗對神經(jīng)元進行綠色標(biāo)記、GFAP一抗配合TRITC標(biāo)記的二抗對膠質(zhì)細(xì)胞進行紅色標(biāo)記、以及Hoechst對細(xì)胞核進行藍(lán)色標(biāo)記，采用高內(nèi)涵技術(shù)分別對標(biāo)記神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞核的熒光強度進行檢測，觀察Aβ42對神經(jīng)突外向生長的影響。結(jié)果表明，Aβ42300 nmol·L－1～30 μmol·L－1的可顯著減少神經(jīng)突外向生長，但卻不減少神經(jīng)元的數(shù)目。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體拮抗劑美金剛和煙堿乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)選擇性激動劑PNU-282987可減弱Aβ42縮減神經(jīng)突外向生長的作用。α7 nAChR拮抗劑甲基牛扁亭堿(methyllycaconitine)可顯著防止Aβ42導(dǎo)致的突起生長減少。這種基于細(xì)胞能同時全景式(或整板全孔)檢測多個表型的高內(nèi)涵分析技術(shù)在評價神經(jīng)保護藥物方面具有明顯優(yōu)勢［12］。比如，有研究者通過構(gòu)建過表達(dá)四重復(fù)Tau蛋白(4 repeat tau，4R0N)的H4神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，以總Tau和12E8Tau(pS262和pS356)為表型指標(biāo)，可進行高內(nèi)涵siRNA篩選，也可高內(nèi)涵評價激酶對Tau蛋白磷酸化的作用。利用該體系以磷酸化Tau抗體12E8配合Cy5標(biāo)記的二抗對磷酸化tau進行標(biāo)記、以Tau抗體配合FITC標(biāo)記的二抗對總Tau進行標(biāo)記、使用Hoechst對核進行標(biāo)記，使用高內(nèi)涵技術(shù)檢測紅色、綠色和藍(lán)色熒光強度，對572個激酶對Tau蛋白磷酸化的作用進行了評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了3個激酶即EIF2AK2，DYRK1A和AKAP13具有磷酸化12E8Tau的作用［13］。另外，又如使用PC12細(xì)胞和原代培養(yǎng)的小腦顆粒細(xì)胞進行神經(jīng)突外向生長和藥物對神經(jīng)突生長作用的高內(nèi)涵評價［14］;使用自動化細(xì)胞培養(yǎng)和高內(nèi)涵圖像技術(shù)研究高通量shRNA對神經(jīng)細(xì)胞模型SH-SY5Y細(xì)胞系的作用［15］。在神經(jīng)元，使用高內(nèi)涵圖像分析可監(jiān)測嚙齒類皮層混合原代培養(yǎng)神經(jīng)元神經(jīng)突觸生長以及藥物對其影響的情況［16］，并可使用高內(nèi)涵檢測和神經(jīng)突圖像定量軟件分析Aβ對小鼠皮層神經(jīng)元神經(jīng)突生長的影響，篩選抑制神經(jīng)突丟失的藥物［17］。

1.2 基于組織的高通量/高內(nèi)涵技術(shù)

在組織水平建立高通量/高內(nèi)涵技術(shù)，可觀察到復(fù)雜的多細(xì)胞相互作用及其表型，則更接近生物體本身的情形，為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中定位或預(yù)測特定表型的功能子網(wǎng)或模塊(module)的基本數(shù)據(jù)獲取提供了手段。

1.2.1 數(shù)字切片掃描技術(shù)

數(shù)字切片掃描技術(shù)是一種現(xiàn)代數(shù)字系統(tǒng)與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡有機結(jié)合的技術(shù)，它將傳統(tǒng)的玻璃病理切片通過全自動顯微鏡掃描采集得到高分辨數(shù)字圖像，再應(yīng)用計算機對得到的圖像自動進行高精度、多視野、無縫隙拼接和處理，以獲得優(yōu)質(zhì)的整片及其整片可視化數(shù)據(jù)。數(shù)字切片系統(tǒng)主要由自動掃描顯微鏡系統(tǒng)、圖像采集(數(shù)碼攝像頭)系統(tǒng)、自動圖像掃描采集控制軟件、數(shù)字切片瀏覽器、圖像處理軟件和計算機、自動上片系統(tǒng)等組成。這種高通量/高內(nèi)涵的獲取和定量分析整片(無偏)組織病理圖像技術(shù)，不但對于疾病的基本病理生理學(xué)和疾病進程的研究具有重要應(yīng)用價值，而且可為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究快速提供準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。目前主要有3種掃描技術(shù)，即線性掃描(line scanning)、逐行掃描(progressive scanning)和光矩陣掃描(optical matrix scanning)。

線性掃描技術(shù)的核心是時間延遲積分(time delay integration，TDI)線性掃描，在40×模式分辨率可達(dá)到0.23μm/像素，且具備紅、綠、藍(lán)三基色通道，可以實現(xiàn)掃描樣本的原色恢復(fù)。使用該技術(shù)的目前主要有Aperio ScanScope?CS、Aperio ScanScope?XT、Hamamatsu C9600 NanoZoomerTM等系統(tǒng)。如使用NanoZoomer系統(tǒng)可一次將210張組織切片裝載在切片盒中，數(shù)字切片掃描系統(tǒng)可自動上載切片，以20×或40×掃描，整片定量分析石蠟包埋和冰凍切片以及涂片特定指標(biāo)(如Aβ斑塊)的免疫組化(明場)或免疫熒光(多色熒光)結(jié)果［18－20］。獲得的數(shù)字切片可用于本地和遠(yuǎn)程分析/診斷。采用上述系統(tǒng)在8 h內(nèi)可獲取32張染色的AD病人腦切片圖片并分析出可靠結(jié)果，22 h內(nèi)可獲取100張APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織切片并分析出可靠結(jié)果，能夠準(zhǔn)確區(qū)分AD和非AD患者［21］。使用Aperio ScanScope系統(tǒng)不但能夠定量評估病毒導(dǎo)致的淋巴細(xì)胞浸潤、小膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)退化［22］，而且通過對45例AD病人的腦切片研究表明，腦萎縮的速率不是由灰質(zhì)中的不溶性Aβ量來決定的，腦萎縮/腦室擴大的速率與總Aβ、可見Aβ增加速率無關(guān)，而與年齡、Braak神經(jīng)原纖維纏結(jié)階段、認(rèn)知變化緊密相關(guān)［23］。

逐行掃描是指每一幀圖像均是由電子束自左到右、并沿垂直方向自上到下以均勻速度依次一行緊接一行連續(xù)掃描而成。15 mm×15 mm的切片可掃描獲得800幀圖片，圖片分辨率為1280×1024像素。使用該技術(shù)的目前主要有Nikon Coolscope，Olympus dotSlide，Zeiss MIRAX Scan，Zeiss MIRAX Midi和Zeiss MIRAX Desk等系統(tǒng)。研究表明，使用逐行掃描技術(shù)的Zeiss MiraxScan系統(tǒng)的準(zhǔn)確率、敏感性、分辨率與傳統(tǒng)切片相同，但其卻具有整片性、存貯方便、可遠(yuǎn)程分析和診斷的優(yōu)點［24］。使用Zeiss MiraxScan系統(tǒng)建立了包括普通絨毛猴(Callithrix jacchus)、恒河猴(rhesus monkey)、日本猴(Japanese monkey)在內(nèi)的猴脊索的數(shù)字切片庫［25］。同樣使用逐行掃描技術(shù)的Nikon Coolscope系統(tǒng)已被用于對肺癌的遠(yuǎn)程診斷［268］以及對丙戊酸導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞系核結(jié)構(gòu)變化的研究［27］。

光矩陣掃描技術(shù)使用微型透鏡陣列和傳感器陣列進行區(qū)域掃描，其分辨率為0.5μm。使用該技術(shù)的目前主要有DMetrix DX-40系統(tǒng)，該系統(tǒng)已被應(yīng)用于乳腺癌和乳腺增生病理切片的遠(yuǎn)程診斷、教學(xué)和學(xué)術(shù)交流中［28］。

1.2.2 高通量神經(jīng)電生理記錄技術(shù)

包括有多個微電極(刺激電極和記錄電極)陣列技術(shù)的神經(jīng)電生理記錄系統(tǒng)可以無創(chuàng)無標(biāo)記的在組織上進行多通道神經(jīng)電生理信號采集和記錄，其高通量特性適于藥物處理后急性分離腦片、藥物處理培養(yǎng)腦片的誘發(fā)性活動(場興奮性突觸后電位)、自發(fā)性活動(尖峰波形信號)、突觸可塑性(長時程增強和長時程抑制)等的研究，也適于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中基于網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測模型的驗證研究。目前，該類技術(shù)報道較多的有兩種，分別為MED64平面微電極陣列系統(tǒng)(Alpha Med Science，Japan)和多電極陣列 (multielectrode arrays，MEA)系統(tǒng)(MultiChannelSystems，Germany)。

MED64平面微電極陣列技術(shù)采用鉑黑微電極陣列，可同時獲取64個位點的電生理信號，而且所有電極既可用作記錄電極，也可用作刺激電極。使用該技術(shù)在急性分離的海馬片上研究表明，NMDA受體的NR2亞基可能是皮層網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生的關(guān)鍵，在癲癇發(fā)作過程中可導(dǎo)致募集更大范圍的震蕩［29］。將大鼠海馬腦片培養(yǎng)在該系統(tǒng)的多電極微陣列上進行電生理信號的采集和記錄，發(fā)現(xiàn)重復(fù)的長時程抑制誘發(fā)刺激能夠促使培養(yǎng)的海馬腦片突觸前和突觸后結(jié)構(gòu)的分離，突觸的消除伴隨著海馬神經(jīng)元功能可塑性的變化［30］。

多電極陣列系統(tǒng)至少含有直徑為30μm用硝酸纖維素包被的60根氮化鈦電極，以8×8的陣列進行排列?？赏瑫r使用4個放大器，采集卡能夠同時處理多達(dá)128通道的信號。使用該技術(shù)在海馬腦片上可檢測神經(jīng)突退化的兩個階段即神經(jīng)突快速腫脹階段(比對照高的電阻并緊跟一個較慢的崩潰相)和片段化階段(比對照低的電阻)以監(jiān)測神經(jīng)軸突退化情況，評價Tau蛋白磷酸化對神經(jīng)元的損害［31］。

1.3 基于模式生物的高通量/高內(nèi)涵技術(shù)

基于模式生物(如果蠅、線蟲、爪蟾和斑馬魚等)的高通量/高內(nèi)涵技術(shù)，不但可在整體生物體生理環(huán)境下研究生長、發(fā)育和疾病的機制，篩選和評價藥物，而且可從網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建、網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)拓?fù)鋵W(xué)和功能拓?fù)鋵W(xué)的分析到網(wǎng)絡(luò)預(yù)測模型的建立等各個層面上揭示藥物的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作用原理。目前研究較多的有線蟲(Caenorhabditis elegans)和斑馬魚。

1.3.1 線蟲

線蟲是細(xì)胞定數(shù)動物，神經(jīng)系統(tǒng)僅有302個細(xì)胞，約占整個動物體細(xì)胞總數(shù)的三分之一。胚胎平均大小為50μm，成蟲為1 mm長、30μm寬，蟲體透明。線蟲神經(jīng)系統(tǒng)含有高等動物腦的大多數(shù)分子成分，身體其余系統(tǒng)亦含有類似人類的多個分子成分，可用于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究。如利用線蟲建立機械刺激學(xué)習(xí)模型、溫度趨向性模型、有害刺激學(xué)習(xí)模型和NaCl物質(zhì)學(xué)習(xí)模型，采用高內(nèi)涵技術(shù)檢測藥物對其行為學(xué)的作用，觀察神經(jīng)元發(fā)育及神經(jīng)極性的變化等。

Albrecht等［32］建立了一種可允許線蟲自主爬行的微流控制系統(tǒng)，可對線蟲的行為進行高內(nèi)涵分析。該微流裝置2 cm×2 cm，布滿直徑為200μm的圓柱形突起，兩突起中心距離300μm，液體在突起間流動。上下游有障礙以限制線蟲的活動區(qū)域，具有刺激輸入口和輸出口以及蟲體入口。有時間脈沖、空間分布和線性濃度梯度3種刺激模式。這些刺激均通過水相傳遞，從而消除了氣-液轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的控制差異。每個刺激模式都有3個參數(shù):轉(zhuǎn)向動力學(xué)、進入氣味帶的方向以及速度(可通過氣味調(diào)節(jié))。該裝置可同時測試4種刺激和4個獨立的蟲群。利用該裝置通過定量分析幾十種行為參數(shù)，已定義了野生型線蟲和感知突變型線蟲預(yù)期的和非預(yù)期的反應(yīng)。這種基于線蟲的高通量/高內(nèi)涵技術(shù)的建立，可進行行為學(xué)、光遺傳學(xué)、鈣成像分析或進行高通量藥物篩選等，并可應(yīng)用于神經(jīng)環(huán)路的功能及其遺傳和分子機制的研究。

使用脂滴特異性染料Bodipy 493/503對脂肪染色并采用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合顯微鏡觀察的方法對線蟲的代謝進行研究，結(jié)果表明，Bodipy對固定的和活的線蟲染色均能看見主要脂肪存貯、天然脂滴形態(tài)，并可定量分析每個蟲體所含的脂肪量。飲食限制、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)和種系突變可表現(xiàn)出各自特異的脂肪/蟲體積比率。這種方法能夠敏感、準(zhǔn)確和高通量的在單個線蟲水平評估大群體線蟲的肥胖情況［33］。

基因譜的高內(nèi)涵篩選往往限于單個細(xì)胞，Green等［34］建立了一種基于多細(xì)胞生物復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)的分析方法。他們通過對線蟲性腺組織結(jié)構(gòu)成像，獲得了554個線蟲必需基因，可分為94個表型。為了尋求網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的評價標(biāo)準(zhǔn)，將這554個基因分成102個表型組，用于預(yù)測不同細(xì)胞生理途徑的基因的功能。進而基于基因間連接重要性的分級，建立了利用高內(nèi)涵數(shù)據(jù)譜構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定的計算方法。這種在復(fù)雜組織采用多參數(shù)譜構(gòu)建的功能圖譜與來源于真核單細(xì)胞的基因相互作用譜具有相似的分辨率。這種基于整體動物或復(fù)雜組織表型譜的高分辨率基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建方法為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究提供了有力的實驗研究工具。

1.3.2 斑馬魚(Danio rerio，zebrafish)

作為脊椎動物，斑馬魚與人類的基因同源性很高。斑馬魚的胚胎和幼魚身體透明，眼部相對較大，胚胎平均大小為1.2 mm，成蟲為6 cm，便于形態(tài)學(xué)檢測和發(fā)育過程觀察。利用活體成像技術(shù)可實時觀測相關(guān)蛋白的表達(dá)、特定表型的(神經(jīng))細(xì)胞分布、神經(jīng)生長或突觸發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中神經(jīng)元損傷后存活和修復(fù)及髓鞘再生等現(xiàn)象。另外，也可使用斑馬魚制造多種疾病模型以用于藥物篩選和評價，如針對人的 APP，PSEN1，PSEN2，NCSTN，PSENEN和 BACE1，斑馬魚有與之對應(yīng)的基因 APPa/b，psen1，psen2，ncstn，psenen和 zgc:77409。有人使用反義嗎啡林(morpholino，MO)對斑馬魚的Pen-2(presenilin enhancer)基因的表達(dá)進行敲減探討了Pen-2對神經(jīng)存活的影響及其可能的機制［35］，為AD發(fā)病機制及防治藥物研究提供了新的模型和實驗體系。此外，也有人使用 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)誘導(dǎo)斑馬魚帕金森氏病模型［36］，使用五甲烯四氮唑(pentylenetetrazol，PTZ)誘導(dǎo)斑馬魚癲癇模型［37］等。這些研究提示斑馬魚在神經(jīng)退行性疾病的研究中具有較為廣泛的應(yīng)用范圍和應(yīng)用前景。

基于報告基因，使用活的斑馬魚，可建立整體動物模型的高通量高內(nèi)涵原位檢測技術(shù)，從而實現(xiàn)活體藥物的篩選和評價。如基于報告基因青色熒光蛋白(cyan fluorescent protein，CFP)、綠色熒光蛋白(GFP)、黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)、非穩(wěn)定單體黃色熒光蛋白(destabilized monomeric yellow fluorescent protein，PhiYFP-dest1)、單體紅色熒光蛋白(monomeric red fluorescent protein，tagRFP)、mCherry、2'，7'-二氯二氫-二乙酸鹽(2'，7'-dichlorodihydrofluorescein-diacetate，DCFH-DA)，使用熒光讀板機，每天可至少檢測50 000個測試(unit)，其 Z'因子≥0.5，可使用斑馬魚胚胎、卵、幼蟲定量分析細(xì)胞數(shù)量(如胰腺β細(xì)胞、視桿光感受器等)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(如轉(zhuǎn)Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體基因斑馬魚等)、細(xì)胞代謝(如活性氧積聚等)等［38］。Peravali等［39］使用斑馬魚基于標(biāo)準(zhǔn)寬域掃描顯微鏡建立了一種具有細(xì)胞分辨率的自動智能化高內(nèi)涵技術(shù)，使用該技術(shù)建立了轉(zhuǎn)基因斑馬魚的胚胎腦3-D數(shù)據(jù)庫。而且根據(jù)背部準(zhǔn)確定位，可獲得高分辨率內(nèi)部器官和細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖像。使用轉(zhuǎn)基因斑馬魚，采用定量的、高內(nèi)涵圖像分析技術(shù)在多孔板在體檢測藥物對纖維生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，結(jié)果表明包含F(xiàn)DA批準(zhǔn)的藥物在內(nèi)的1040個化合物有兩個分子即8－羥基喹啉硫酸酯(8-hydroxyquinoline sulfate)和巰氧吡啶鋅(pyrithione zinc)具有增強腦中特定區(qū)域FGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用［40］。

2 雙高通量基因表達(dá)檢測技術(shù)

在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)研究中，不論是基于實驗的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建所需基本數(shù)據(jù)的獲取，還是對所構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)模型進行實驗驗證，均需要使用具有檢測樣品高通量、檢測目標(biāo)基因高通量的雙高通量、快捷、準(zhǔn)確、靈敏的技術(shù)。顯然，基于核酸雜交的基因芯片技術(shù)(基因組芯片、cDNA芯片、Oligo芯片、miRNA芯片等)因其每次只能檢測一對樣品而限制了其在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中的應(yīng)用。

2002年Fakhari［41］提出的 PCR芯片技術(shù)，是將與研究對象有關(guān)的基因的引物固定于固相載體上，形成陣列，通過簡單的、經(jīng)過優(yōu)化的定量PCR體系和熒光定量PCR儀，實現(xiàn)待檢樣品中基因的擴增，進而用于定量檢測待檢樣品中基因的表達(dá)情況。與傳統(tǒng)基于核酸雜交的基因芯片相比，PCR芯片具有操作流程簡單、定量結(jié)果無需后期驗證、特異性強、靈敏度高以及重復(fù)性好等優(yōu)點。目前報道較多的有OpenArray?System(Applied Biosystems，USA)和 BioMark? System(Fluidigm，USA)。

OpenArray?System PCR芯片可同時檢測96個樣品的96個PCR反應(yīng)，或每個樣品可同時檢測9216種基因。在一項基于中國人的病例-對照研究中，使用OpenArray? System檢測了580例男性不育癥和580例對照的6個抗氧化基因GPX1，CAT，PON1，NQO1，SOD2/MnSOD和SOD3的11個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)并進行基因分型，結(jié)果表明 PON1 Arg192Glu(rs662)和 SOD2 Val16Ala(rs4880)變異基因型與高風(fēng)險男性不育癥相關(guān)，攜帶有這兩個變異基因型的個體其不育癥發(fā)生風(fēng)險高出兩倍，而且這兩個基因間存在互作。攜帶有PON1 Arg192Glu(rs662)或SOD2 Val16Ala(rs4880)的個體其精子DNA片段化和8－OHdG的水平也顯著增高。表明抗氧化基因的遺傳變異可導(dǎo)致精子DNA損傷與男性不育［42］。介導(dǎo)二噁英和多環(huán)芳?xì)涞拳h(huán)境化合物毒性的配體激活轉(zhuǎn)錄因子芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AHR)的 SNP 中，rs2158041 的 G突變也與中國人男性不育有關(guān)［43］。同樣在強直性脊柱炎研究中發(fā)現(xiàn)，基因STAT3，TNFRSF1A和2p15的多態(tài)性與中國漢族人的強直性脊柱炎有關(guān)［44］。另外，該系統(tǒng)也已用于O157和非O157型腸出血性大腸桿菌中與毒性、血清分型和噬菌體作用區(qū)有關(guān)的基因表達(dá)檢測［45］。

BioMark?System集成流體通道(integrated fluidic circuits，IFC)PCR芯片目前最多可同時進行36 960個PCR反應(yīng)。使用該系統(tǒng)的48×48動態(tài)陣列檢測128例Ⅱ～Ⅲ期直腸癌患者血液中胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TS)、表皮生長因子(epidermal growth factor receptor)、切除修復(fù)交叉互補基因1(excision repair cross－complementing 1)、X射線修復(fù)交叉互補組1(X-ray repair cross-complementing group 1，XRCCG1)、著色性干皮病D組(xeroderma pigmentosum group D)基因的多態(tài)性，結(jié)果表明TS的基因多態(tài)性和XRCCG1 Arg399Gln多態(tài)性可輔助指示同步放化療有較好預(yù)后的Ⅱ～Ⅲ期直腸癌患者［46］。同樣使用該系統(tǒng)的48×48動態(tài)陣列檢測了抗表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)抗體片段 C 部分(antibody fragment C portion，F(xiàn)cγ)多態(tài)性和KRAS基因突變與104例用抗-EGFR抗體治療的難治性轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(refractory metastatic colorectal cancer，mCRC)臨床療效的相關(guān)性，結(jié)果表明，F(xiàn)ccRIIa和FccRIIIa多態(tài)性并不是mCRC病人臨床療效有用的分子標(biāo)記。因此，迄今為止，癌癥分類的研究和治療歐洲組織(European Organization for Research and Treatment of Cancer Classification，EORTC)、皮膚毒性和KRAS基因狀態(tài)是唯一可靠的生物標(biāo)志物，以確定患者受益于抗EGFR治療［47］。另外，使用該系統(tǒng)對33例司他夫定(stavudine，d4T)處理的病人TS、亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)、二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)、還原葉酸載體1(reduced folate carrier 1，RFC1;SLC19A1)和細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)的基因多態(tài)性，結(jié)果表明TS基因的多態(tài)性與胞內(nèi)司他夫定三磷酸腺苷(d4T-TP)水平和艾滋病毒/高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療相關(guān)的脂肪代謝障礙綜合征(HIV/highly active antiretroviral therapy-associated lypodystrophy syndrome，HALS)病程高度相關(guān)［48］。

3 分子相互作用技術(shù)

從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度揭示藥物作用原理或?qū)λ鶚?gòu)建的藥物作用網(wǎng)絡(luò)或預(yù)測模型進行驗證的本質(zhì)在于揭示藥物分子與機體生物大分子之間的相互作用關(guān)系，因此需要觀察藥物與單個及多個生物分子之間的相互作用，同時也需要觀察多個生物分子之間的相互作用。目前研究分子相互作用的方法有很多，但從檢測通量和分子量范圍來講，主要有兩種，一種是基于表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)的檢測技術(shù)，另一種是基于生物膜層干涉(Bio-Layer Interferometry，BLI)的檢測技術(shù)，這兩種技術(shù)均具有無標(biāo)記、高通量、高精度且實時檢測的特點，能夠提供分子相互作用結(jié)合速率常數(shù)(Ka)、解離速率常數(shù)(Kd)和親和常數(shù)(KD)。

SPR技術(shù)的基本原理是當(dāng)入射光以臨界角射入，在金屬膜表面內(nèi)發(fā)生全反射，產(chǎn)生消失波，一定條件下消失波激發(fā)金屬表面自由電子使之成為等離子體，而當(dāng)表面等離子體與消失波的頻率波數(shù)相等時，此時將發(fā)生共振現(xiàn)象并出現(xiàn)共振峰。當(dāng)金屬表面樣品的折射率發(fā)生變化，共振峰的位置會發(fā)生相應(yīng)的變化，由此可以檢測待測物與配體發(fā)生的結(jié)合情況。金屬與介質(zhì)表面的存在是形成表面等離子體共振的基本條件之一，而檢測生物分子間相互作用的特異性主要取決于偶聯(lián)在傳感器芯片表面的配體的特性。SPR生物傳感器對溫度和流體的湍流情況比較敏感，適于檢測分子量較大(＞1000 Da)的分子。如在AD發(fā)病機制研究中，使用SPR技術(shù)研究Aβ聚集和寡聚體形成機制時，檢測到Aβ42與微管聚合促進蛋白(tubulin polymerization promoting protein，TPPP/p25)的結(jié)合KD為85 nmol·L－1，可通過抑制生理性相關(guān)的TPPP/p25源微管聚集而導(dǎo)致異常蛋白的聚集［49］。Neuroligin-1(NL-1)是興奮性突觸的一個特異突觸后細(xì)胞粘附蛋白，NL-1與Aβ的結(jié)合KD在nmol·L－1水平，而NL-2(抑制性突觸的一個特異突觸后細(xì)胞粘附蛋白)則與Aβ結(jié)合非常弱，研究表明NL-1而不是NL-2與Aβ相互作用增加Aβ寡聚體的形成［50］。在AD藥物發(fā)現(xiàn)和藥物機制研究中，基于SPR技術(shù)，將從腦脂質(zhì)提取物分離的脂質(zhì)膜固定在芯片上，并通過識別β-分泌酶(β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1，BACE1)的C-末端的抗體捕獲BACE1，然后進行與BACE1相互作用分子的研究。這種技術(shù)能夠更好的在接近生理條件下研究與BACE1相互作用的分子［51］，從而篩選BACE1抑制劑。使用SPR技術(shù)，檢測人血白蛋白(Albutein)與sAβ42的結(jié)合KD的結(jié)果表明，血白蛋白可以與Aβ結(jié)合，可能對AD具有治療作用［52］。γ-分泌酶調(diào)節(jié)劑舒林酸硫化物(sulindac sulfide)及其衍生物可直接與Aβ序列結(jié)合，而且γ-分泌酶調(diào)節(jié)劑和APP跨膜序列結(jié)合的減弱與Aβ42活性的降低、Aβ序列結(jié)合的強度高度相關(guān)，表明γ-分泌酶抑制劑降低Aβ42水平是通過調(diào)節(jié)APP跨膜序列相互作用來達(dá)到的［53］。

BLI的原理是用生物分子相容層覆蓋光纖制成的生物傳感器底端，用來固定相互作用分子中的一個，形成生物膜層。當(dāng)分子相互作用發(fā)生時，生物層厚度增加，反射光干涉光譜曲線整體向波長增加方向移動。分子結(jié)合或解離時，都會導(dǎo)致干涉曲線的漂移。能直接檢測血清、細(xì)胞裂解液、細(xì)菌、細(xì)胞培養(yǎng)液、組織勻漿等樣品［54］。使用BLI技術(shù)在食蟹猴血漿中定量檢測人源化抗體治療療效，結(jié)果表明，BLI技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)技術(shù)具有同等的選擇性、基質(zhì)效應(yīng)、精度和準(zhǔn)確度，但靶點干擾方面BLI則優(yōu)于ELISA。ELISA 的動態(tài)檢測范圍在0.1 ～10 mg·L－1，而BLI為0.4 ～50 mg·L－1。而且對于低濃度樣品，BLI的重復(fù)性要高于ELISA［55］。BLI技術(shù)可以96和384孔的通量進行生物分子相互作用的檢測，與SPR相比，更適于小分子特征的研究和片段篩選，通過以BCL-2，JNK1和eIF4E為靶點對6500個化合物的篩選，結(jié)果表明BLI技術(shù)不但可確證生物化學(xué)方法檢測的結(jié)果，而且能夠發(fā)現(xiàn)生化方法難以揭示的有著非典型結(jié)合譜的化合物和新候選化合物［54］。

4 展望

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從生物網(wǎng)絡(luò)的角度系統(tǒng)地揭示藥物和機體相互作用的規(guī)律和原理，發(fā)現(xiàn)基于網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)的疾病發(fā)病機制及藥物作用靶點，創(chuàng)制基于生物網(wǎng)絡(luò)的候選新藥。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實驗研究的技術(shù)與方法要求具有高通量、可定量、快速、靈敏度和準(zhǔn)確性高的特點。除了組學(xué)技術(shù)外，目前能夠在該領(lǐng)域發(fā)揮主要作用的有高通量/高內(nèi)涵技術(shù)、雙高通量基因表達(dá)檢測技術(shù)和分子相互作用技術(shù)。但這些技術(shù)尚存在明顯缺陷，僅能解決網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實驗研究中遇到的部分問題，如多數(shù)僅能實現(xiàn)分子或細(xì)胞水平的研究、可同時觀察或檢測的分子或生物效應(yīng)有限、難以全面揭示生物機體內(nèi)分子間及其與藥物之間的復(fù)雜相互作用關(guān)系等等，因此，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實驗研究相關(guān)新技術(shù)新方法的誕生仍是亟待解決的難題。

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