張楠楠，梁錦鋒，宋淑亮，吉愛國(guó)

(1.山東大學(xué)藥學(xué)院生化與生物技術(shù)藥物研究所，山東 濟(jì)南 250012;2.山東大學(xué)威海國(guó)際生物技術(shù)研發(fā)中心，山東 威海 264209;3.浙江省藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心，浙江 杭州 310012)

發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)于很多工業(yè)化學(xué)物和污染物具有較強(qiáng)的易感性，由于血腦屏障尚未發(fā)育完全，某些毒劑在發(fā)育腦中的積累量會(huì)高于成人，而且發(fā)育過(guò)程中化學(xué)物暴露能引起持久的神經(jīng)功能障礙［1］。而神經(jīng)功能損傷會(huì)給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)，因此，對(duì)化學(xué)物的神經(jīng)發(fā)育毒性(developmental neurotoxicity，DNT)的潛在危害進(jìn)行評(píng)價(jià)尤為重要?，F(xiàn)行DNT實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)是由美國(guó)環(huán)境保護(hù)署頒布的OPPTS 870.6300及世界經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織頒布的TG426草案，但是這些實(shí)驗(yàn)均采用整體哺乳動(dòng)物進(jìn)行研究，費(fèi)用高、時(shí)間長(zhǎng)且動(dòng)物需求量大，很難利用其對(duì)500多萬(wàn)種化合物進(jìn)行DNT檢測(cè)［2］。另外，以替代、減少和優(yōu)化為核心的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法已被越來(lái)越多的科學(xué)家所認(rèn)同，因此，建立動(dòng)物替代實(shí)驗(yàn)來(lái)快速和可靠地鑒定化合物的DNT已經(jīng)迫在眉睫。本文對(duì)DNT實(shí)驗(yàn)替代方法的建立原則及其研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 神經(jīng)發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)替代方法的建立原則

理想DNT實(shí)驗(yàn)替代模型最重要的特征就是模型的科學(xué)有效性，這就意味著它能預(yù)測(cè)人類處在發(fā)育階段的神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)毒性反應(yīng)［3］。在遺傳毒理學(xué)中，模型的預(yù)測(cè)能力是由檢測(cè)終點(diǎn)與已知毒理學(xué)生物機(jī)制之間的關(guān)聯(lián)性所決定的，同樣，理想的DNT實(shí)驗(yàn)替代模型就是以與DNT相關(guān)的保守生物機(jī)制為基礎(chǔ)的。理想的DNT實(shí)驗(yàn)替代模型的另一個(gè)特征是靈敏、專一并且適合高通量篩選［4］。在這些特征的基礎(chǔ)之上，結(jié)合替代、減少和優(yōu)化原則以及神經(jīng)發(fā)育生物學(xué)的現(xiàn)狀，目前有兩類模型系統(tǒng)作為DNT實(shí)驗(yàn)的替代模型:體外細(xì)胞模型和非哺乳動(dòng)物模型。下面主要討論這兩類模型系統(tǒng)在DNT實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用以及它們實(shí)現(xiàn)替代、減少和優(yōu)化原則的潛能。

2 神經(jīng)發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)的替代方法

2.1 體外細(xì)胞模型

神經(jīng)毒性效應(yīng)可以在總體形態(tài)或基礎(chǔ)行為不變的情況下產(chǎn)生，若要發(fā)現(xiàn)未受損大腦中細(xì)微的結(jié)構(gòu)改變(如細(xì)胞數(shù)目或位置的改變以及突觸連接的變化)，不僅耗時(shí)長(zhǎng)，有時(shí)還需要依靠專業(yè)的技能和昂貴的儀器設(shè)備。另外，由于人們尚不了解可能受到毒性物質(zhì)影響的腦區(qū)以及在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)毒性反應(yīng)的具體階段［5］，因此，利用上述技術(shù)進(jìn)行大量化學(xué)物篩選不僅花費(fèi)驚人，而且并不能保證可以檢測(cè)到突觸連接、神經(jīng)遞質(zhì)功能或細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變。

體外細(xì)胞模型能夠成為DNT實(shí)驗(yàn)替代方法，主要原因有:①利用體外細(xì)胞模型模擬神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵事件，可以檢測(cè)到細(xì)胞增殖、細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及神經(jīng)遞質(zhì)合成或功能上的輕微變化。②從體外細(xì)胞模型的數(shù)據(jù)可研究相關(guān)的分子、細(xì)胞、局部區(qū)域以及易受損傷的發(fā)育階段，因此，集中并且減少了動(dòng)物研究。③許多DNT物質(zhì)，不論其具體作用機(jī)制如何，都具有相同的毒性作用終點(diǎn)，如改變細(xì)胞分裂或存活、擾亂神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞的分化以及中斷神經(jīng)連接。因此，在細(xì)胞模型中所檢測(cè)到的毒性作用終點(diǎn)均在生物學(xué)上與DNT相關(guān)。④體外細(xì)胞模型有利于描述遺傳毒性的作用機(jī)制以及評(píng)價(jià)物種間作用機(jī)制的保守性［6］。通過(guò)檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞基因表達(dá)，可以將分子數(shù)據(jù)及結(jié)構(gòu)與功能上的觀察結(jié)果整合到一起，這類整合的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)于利用分子終點(diǎn)進(jìn)行的篩選實(shí)驗(yàn)是必要的。

目前，細(xì)胞模型可用于研究神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵事件，包括增殖和凋亡［7］、胚胎干細(xì)胞分化［8］、神經(jīng)細(xì)胞遷移［9］、軸突樹突生長(zhǎng)和突觸發(fā)生［10］、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化和髓鞘形成［11］、神經(jīng)遞質(zhì)合成與功能［12］以及血腦屏障生成［13］。常用模型有神經(jīng)元型細(xì)胞系和膠質(zhì)型細(xì)胞系［14］，還有從神經(jīng)系統(tǒng)不同發(fā)育階段分離的組織，包括純化的原代神經(jīng)元細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，器官型腦片培養(yǎng)［15］。其檢測(cè)終點(diǎn)有細(xì)胞形態(tài)、生化標(biāo)記、神經(jīng)傳遞和分子事件，如基因表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［16］。Radio等［17］以軸突生長(zhǎng)為檢測(cè)指標(biāo)，建立了PC12細(xì)胞的DNT高通量篩選系統(tǒng)，能快速量化化學(xué)物對(duì)軸突生長(zhǎng)的化學(xué)效應(yīng)，并且細(xì)胞活力和軸突生長(zhǎng)的濃度響應(yīng)數(shù)據(jù)可以作為化學(xué)物DNT的檢測(cè)終點(diǎn)。腦片等一些復(fù)雜的體外模型，已用于與功能相關(guān)的復(fù)雜行為研究，比如長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)和突觸可塑性［18］。

在體外神經(jīng)生物學(xué)研究中，分離的大鼠小腦顆粒細(xì)胞是應(yīng)用最廣泛的體外系統(tǒng)，90%原代培養(yǎng)的小腦顆粒細(xì)胞是由小腦顆粒神經(jīng)元組成，可以用于神經(jīng)元的發(fā)育、功能和病理學(xué)研究。盡管沒(méi)有神經(jīng)電路，小腦顆粒細(xì)胞卻具有多條功能通路對(duì)化學(xué)物進(jìn)行應(yīng)答［19］?？傊?，相對(duì)于細(xì)胞系，原代培養(yǎng)物對(duì)毒性物質(zhì)有更高的敏感性［20］。原代培養(yǎng)的小腦顆粒細(xì)胞中還包含膠質(zhì)細(xì)胞，其中，星形膠質(zhì)細(xì)胞可特異性地表達(dá)膠質(zhì)纖維酸性蛋白，它是星形膠質(zhì)細(xì)胞骨架蛋白的特有成分，常作為星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性反應(yīng)的特異性標(biāo)志物，用于研究膠質(zhì)細(xì)胞的毒性反應(yīng)［16］。

迄今為止，大多數(shù)機(jī)制信息是通過(guò)對(duì)非干細(xì)胞正常增殖、永生或致瘤細(xì)胞的研究而獲得的。多數(shù)情況下，這些結(jié)果外推到體內(nèi)后不是很理想。干細(xì)胞技術(shù)為更好地理解毒性機(jī)制和預(yù)測(cè)人體內(nèi)毒性提供了一種新的工具［21］。理想的DNT模型是人胚胎干細(xì)胞。人神經(jīng)祖細(xì)胞、干細(xì)胞系和臍帶血干細(xì)胞等模型，可用于研究前體細(xì)胞向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的分化以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成等神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中的重要事件，而且這些模型可以避免物種不同所致的推測(cè)不確定性［22］。Breier等［23］用多種化合物作用于人神經(jīng)祖細(xì)胞，通過(guò)PI排除法和BrdU摻入法檢測(cè)細(xì)胞活力和增殖情況，建立了以人神經(jīng)祖細(xì)胞為對(duì)象，采用高通量篩選方法評(píng)價(jià)化學(xué)物對(duì)細(xì)胞增殖和活力的影響的DNT檢測(cè)體系。

雖然體外細(xì)胞模型能夠?qū)瘜W(xué)物進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)毒性作用篩選，優(yōu)化和減少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，但是，也存在局限性:① 大部分細(xì)胞系是從腫瘤中得到的永生細(xì)胞，不能代表天然神經(jīng)細(xì)胞真實(shí)狀態(tài)，原代細(xì)胞的很多性質(zhì)會(huì)丟失或與體內(nèi)情況不同。隨著傳代，基因組的不穩(wěn)定性增加。缺少三維結(jié)構(gòu)，不同細(xì)胞類型之間的相互作用變得非常有限。②原代培養(yǎng)物中，細(xì)胞表型和功能會(huì)發(fā)生改變，細(xì)胞代謝和細(xì)胞間相互作用水平顯著降低，這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)化學(xué)物的回應(yīng)發(fā)生改變。另外，初級(jí)神經(jīng)培養(yǎng)物大部分由有絲分裂后的神經(jīng)元組成，這些細(xì)胞不能增殖，模型的生存期受到限制，因此，培養(yǎng)物需要經(jīng)常更換，不適合進(jìn)行高通量篩選。③ 尚不能完全控制神經(jīng)祖細(xì)胞的分化，對(duì)其很多培養(yǎng)特征缺乏了解［24］。④ 發(fā)育中的大腦，其基因表達(dá)類型、發(fā)育周期、神經(jīng)保護(hù)分子的表達(dá)和代償性機(jī)制會(huì)因部位的不同而不同，因此，體外細(xì)胞模型很難解釋神經(jīng)毒性物質(zhì)對(duì)大腦不同部位的毒性作用［18］。⑤神經(jīng)毒性物質(zhì)對(duì)整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)的作用大于對(duì)各個(gè)部分作用的總和。這樣，將發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)簡(jiǎn)化到細(xì)胞亞群或某一區(qū)域的腦片，就不能從總體上研究大腦不同區(qū)域、不同細(xì)胞類型和不同發(fā)育階段間的相互作用和重要差別，而且不易觀察到毒性物質(zhì)對(duì)可以影響神經(jīng)發(fā)育的神經(jīng)外因子(如代謝、免疫調(diào)節(jié)和內(nèi)分泌功能)的毒性作用［25］。

2.2 非哺乳動(dòng)物模型

發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)具有很多比較復(fù)雜的相互依賴過(guò)程，所以，體外細(xì)胞模型很難準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)化學(xué)物的體內(nèi)效應(yīng)，而那些簡(jiǎn)單生物體構(gòu)成的非哺乳動(dòng)物模型可以評(píng)價(jià)完整的生物效應(yīng)，為DNT實(shí)驗(yàn)提供更可行和更快速的替代方法。線蟲、果蠅和斑馬魚已廣泛用于神經(jīng)發(fā)育機(jī)制的研究，而且已經(jīng)掌握它們關(guān)于神經(jīng)發(fā)育的細(xì)胞和分子調(diào)節(jié)方面的相關(guān)理論。研究證實(shí)，盡管這些模型的神經(jīng)發(fā)育與哺乳動(dòng)物有明顯的差異，但是它們神經(jīng)發(fā)育的基礎(chǔ)進(jìn)程與人具有相似性，而且所表達(dá)的基因與人神經(jīng)發(fā)育疾病相關(guān)的基因存在較高的同源性，這說(shuō)明這些模型系統(tǒng)可以用于檢測(cè)化學(xué)物對(duì)人發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)的潛在神經(jīng)毒性［26］。

隨著線蟲、果蠅和斑馬魚基因組測(cè)序的完成，已經(jīng)有能夠監(jiān)測(cè)和調(diào)控這些生物體中基因表達(dá)的技術(shù)，而且某些行為測(cè)試也已被開發(fā)出來(lái)，利用這些工具可以在生物化學(xué)、分子和細(xì)胞水平上對(duì)DNT引起的結(jié)構(gòu)、功能和行為的改變進(jìn)行研究，還可以直接檢測(cè)化學(xué)物與生物化學(xué)、細(xì)胞或分子終點(diǎn)以及行為的原因-效應(yīng)關(guān)系［27］。另外，這些信息可以構(gòu)建用于預(yù)測(cè)物種間DNT潛在危害的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)。以后的研究主要集中在發(fā)展適用于非哺乳動(dòng)物模型的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)、生物化學(xué)和行為學(xué)終點(diǎn)的高通量分析技術(shù)。

非哺乳動(dòng)物模型的一個(gè)最重要的優(yōu)勢(shì)就是這些組織體積小，胚胎發(fā)育快，生活周期短，這大大減少了時(shí)間和空間上的消耗。在這些模型中，斑馬魚呈現(xiàn)出很多線蟲或果蠅所沒(méi)有的特征，如在基因組結(jié)構(gòu)上脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物之間有很顯著的差異。這樣，即使物種間基因具有功能同源性，但是基因調(diào)節(jié)的機(jī)制在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物之間會(huì)有明顯的不同［28］。而且，無(wú)脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)不能反映脊椎動(dòng)物大腦的大小和組成，脊椎動(dòng)物神經(jīng)電路的復(fù)雜性排除了它們與無(wú)脊椎動(dòng)物之間對(duì)大腦的形成和功能進(jìn)行直接比較的可能性，但是，魚類大腦的主要組成部分卻與人腦具有高度的同源性［29］。斑馬魚還具有所有的經(jīng)典感覺形態(tài)，包括視覺、嗅覺、味覺、觸覺、平衡和聽覺，并且它們的感覺傳導(dǎo)通路與人完全相同。認(rèn)知行為測(cè)試表明解剖學(xué)上擔(dān)負(fù)認(rèn)知行為的物質(zhì)在魚和其他脊椎動(dòng)物之間是保守的，這樣，與對(duì)哺乳動(dòng)物海馬損傷的觀察相類似，魚中的海馬結(jié)構(gòu)類似物損傷選擇性地?fù)p害了其空間記憶［30］。

與其他模型相比，斑馬魚的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是其胚胎透明，簡(jiǎn)單的顯微技術(shù)就能在較寬的發(fā)育階段內(nèi)分辨體內(nèi)單個(gè)細(xì)胞，而且，采用能表達(dá)熒光報(bào)道基因的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型可使分辨率提高，用以觀察基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化和活體中發(fā)育胚胎詳細(xì)的形態(tài)發(fā)生運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而可以研究在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中暴露于神經(jīng)毒性物質(zhì)時(shí)的補(bǔ)償機(jī)制［31］。在活體斑馬魚中可見的神經(jīng)發(fā)育事件，包括神經(jīng)誘導(dǎo)、神經(jīng)元遷移、軸突向外生長(zhǎng)和突觸發(fā)生、后腦形態(tài)發(fā)生的分子調(diào)控以及視覺系統(tǒng)的發(fā)育［32］。而且利用這些過(guò)程在同一個(gè)生物體中的重現(xiàn)性還可以進(jìn)行反復(fù)的觀察，因此減少了研究中的動(dòng)物使用量。Yang等［33］將受精24～72 h的斑馬魚受精卵暴露于毒死蜱的代謝產(chǎn)物后，發(fā)現(xiàn)其代謝產(chǎn)物能顯著抑制乙酰膽堿酯酶的活性，并且抑制感覺神經(jīng)元、初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和次級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的軸突生長(zhǎng)，由此表明神經(jīng)連接方式的改變是毒死蜱DNT的一種表現(xiàn)形式。Powers等［34］將斑馬魚胚胎長(zhǎng)期暴露于對(duì)形態(tài)發(fā)育不產(chǎn)生明顯影響的銀離子濃度中，通過(guò)對(duì)斑馬魚神經(jīng)化學(xué)指標(biāo)和行為效應(yīng)的檢測(cè)，證明銀離子是一種能夠引起永久神經(jīng)行為效應(yīng)的神經(jīng)發(fā)育毒劑。

作為模型物種，斑馬魚為研究提供了很多方便，但是它也有一定的缺陷。它的小體積使得生化或遺傳分析對(duì)胚胎或幼蟲的需求量增大，同時(shí)也極大地限制了檢測(cè)和評(píng)估裝置的類型，給包埋和切片增加了難度。其次，斑馬魚發(fā)育進(jìn)程迅速，僅幾個(gè)小時(shí)就可以使其發(fā)育階段或?qū)Χ拘晕镔|(zhì)的敏感性發(fā)生改變，這使得記錄發(fā)育時(shí)段的觀察費(fèi)用得以增加。另外，斑馬魚胚胎起初被包在絨毛膜內(nèi)，它可能會(huì)成為某些化學(xué)物進(jìn)入胚胎的額外屏障。雖然胚胎的卵膜可以通過(guò)機(jī)械法或蛋白酶法去除，但這會(huì)影響胚胎的行為和完整性，同時(shí)也排除了檢測(cè)化學(xué)物對(duì)孵化影響的可能［35］。在毒性研究中，斑馬魚最主要的缺陷是給藥的不可控性。最簡(jiǎn)單的暴露方式是將胚胎置于含有毒性物質(zhì)的溶液中，但實(shí)際到達(dá)胚胎的劑量是不確定的。已有研究表明，真正到達(dá)胚胎/幼蟲的劑量極少會(huì)與周圍水中的藥物濃度相接近［36］。

總之，以非哺乳動(dòng)物為基礎(chǔ)的體內(nèi)DNT實(shí)驗(yàn)替代模型所面臨的主要挑戰(zhàn)是要確定潛在的物種間毒性物質(zhì)代謝動(dòng)力學(xué)和毒性物質(zhì)效應(yīng)動(dòng)力學(xué)的差異。目前已有關(guān)于外源物與人在代謝和細(xì)胞防御機(jī)制上相似程度的探討，如果二者之間存在顯著差別，那么，利用通過(guò)穩(wěn)定表達(dá)人類基因(如代謝酶類)而使其人源化的技術(shù)，可能使這個(gè)難題得到部分解決［37］。

3 神經(jīng)發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)替代方法存在的問(wèn)題和展望

基于神經(jīng)發(fā)育保守機(jī)制的DNT替代模型的重要特征是可對(duì)發(fā)育中的人神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)毒性反應(yīng)進(jìn)行預(yù)測(cè)，因此，無(wú)論基于細(xì)胞培養(yǎng)的體外模型還是基于非哺乳動(dòng)物的體內(nèi)模型，都有必要對(duì)其是否具有這一特征進(jìn)行評(píng)價(jià)。理想DNT替代模型的另一個(gè)特點(diǎn)是應(yīng)用于高通量分析，而且要具有敏感性、專屬性和適用性等優(yōu)點(diǎn)。另外，還要求快速、經(jīng)濟(jì)并且相對(duì)容易實(shí)施。但是，總體上，無(wú)論是體外還是體內(nèi)替代模型，均存在如下問(wèn)題:①其所得數(shù)據(jù)均不能對(duì)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性、專屬性和敏感性進(jìn)行充分的評(píng)價(jià)。所以，目前要做的工作是建立一組可以檢測(cè)DNT實(shí)驗(yàn)替代模型的參照化合物［38］，進(jìn)而利用這些不同機(jī)制的DNT化合物對(duì)不同候選模型進(jìn)行測(cè)試。②DNT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的收集、存儲(chǔ)和分析。最理想的情況是每一個(gè)參與者在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中共享DNT實(shí)驗(yàn)替代模型發(fā)展和檢測(cè)的相關(guān)信息。除了要鑒別收集有關(guān)資源來(lái)建立和維持這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，還要運(yùn)用計(jì)算毒理學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)，使結(jié)構(gòu)和功能的數(shù)據(jù)與基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)得以結(jié)合［37］。

從體外細(xì)胞模型和非哺乳動(dòng)物模型的DNT實(shí)驗(yàn)替代法獲得的數(shù)據(jù)，有利于對(duì)相關(guān)細(xì)胞、分子和局部靶點(diǎn)更深入的理解，由此可以提出化學(xué)物作用方式的相關(guān)假說(shuō)，鑒別潛在的易損發(fā)育階段，繼而優(yōu)化和減少哺乳動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)保障兒童健康的最終目標(biāo)。目前，雖然DNT替代實(shí)驗(yàn)不能完全取代哺乳動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，但是，DNT替代模型在區(qū)分化學(xué)物以及優(yōu)化和減少哺乳動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中有重大價(jià)值。

［1］Andersen HR，Nielsen JB，Grandjean P.Toxicologic evidence of developmental neurotoxicity of environmental chemicals［J］.Toxicology，2000，144(1-3):121-127.

［2］Kuegler PB，Zimmer B，Waldmann T，Baudis B，Ilmj?rv S，Hescheler J，et al.Markers of murine embryonic and neural stem cells，neurons and astrocytes:reference points for developmental neurotoxicity testing［J］.ALTEX，2010，27(1):17-42.

［3］Lilienblum W，Dekant W，F(xiàn)oth H，Gebel T，Hengstler JG，Kahl R，et al.Alternative methods to safety studies in experimental animals:role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation(REACH)［J］.Arch Toxicol，2008，82(4):211-236.

［4］Bal-Price AK，Su?ol C，Weiss DG，van Vliet E，Westerink RH，Costa LG.Application of in vitro neurotoxicity testing for regulatory purposes:SymposiumⅢ summary and research needs［J］.Neurotoxicology，2008，29(3):520-531.

［5］Coecke S，Eskes C，Gartlon J，Kinsner A，Price A，van Vliet E，et al.The value of alternative testing for neurotoxicity in the context of regulatory needs［J］.Environ Toxicol Pharmacol，2006，21(2):153-167.

［6］H?gberg H.Alternative in vitro and non-mammalian models relevant to DNT evaluation［M］∥H?gberg H.Developmental Neurotoxicity Testing Using In vitro Approaches.Stockholm:Universitetsservice AB，2009:27-33.

［7］Moors M，Rockel TD，Abel J，Cline JE，Gassmann K，Schreiber T，et al.Human neurospheres as three-dimensional cellular systems for developmental neurotoxicity testing［J］.Environ Health Perspect，2009，117(7):1131-1138.

［8］Tamm C，Duckworth J，Hermanson O，Ceccatelli S.High susceptibility of neural stem cells to methylmercury toxicity:effects on cell survival and neuronal differentiation［J］.J Neurochem，2006，97(1):69-78.

［9］Ayala R，Shu T，Tsai LH.Trekking across the brain:the journey of neuronal migration［J］.Cell，2007，128(1):29-43.

［10］Spitzer NC.Electrical activity in early neuronal development［J］.Nature，2006，444(7120):707-712.

［11］Simons M，Trotter J.Wrapping it up:the cell biology of myelination［J］.Curr Opin Neurobiol，2007，17(5):533-540.

［12］Collier TJ，Steece-Collier K，McGuire S，Sortwell CE.Cellular models to study dopaminergic injury responses［J］.Ann N Y Acad Sci，2003，991:140-151.

［13］Yang J，Aschner M.Developmental aspects of blood-brain barrier(BBB)and rat brain endothelial(RBE4)cells as in vitro model for studies on chlorpyrifos transport［J］.Neurotoxicology，2003，24(4-5):741-745.

［14］Tiffany-Castiglioni E，Ehrich M，Dees L，Costa LG，Kodavanti PR，Lasley SM，et al.Bridging the gap between in vitro and in vivo models for neurotoxicology［J］.Toxicol Sci，1999，51(2):178-183.

［15］G?hwiler BH，Thompson SM，Mckinney RA，Debanne D，Robertson RT.Organotypic slice cultures of neural tissue［M］∥Banker G，Goslin KE.Culturing Nerve Cells.2nd ed.Cambridge:MIT Press，1998:461-498.

［16］Hogberg HT，Kinsner-Ovaskainen A，Coecke S，Hartung T，Bal-Price AK.mRNA expression is a relevant tool to identify developmental neurotoxicants using an in vitro approach［J］.Toxicol Sci，2010，113(1):95-115.

［17］Radio NM，Breier JM，Shafer TJ，Mundy WR.Assessment of chemical effects on neurite outgrowth in PC12 cells using high content screening［J］.Toxicol Sci，2008，105(1):106-118.

［18］Lein P，Locke P，Goldberg A.Meeting report:alternatives for developmental neurotoxicity testing［J］.Environ Health Perspect，2007，115(5):764-768.

［19］Contestabile A. Cerebellargranule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro［J］.Cerebellum，2002，1(1):41-55.

［20］Costa LG.Neurotoxicity testing:a discussion of in vitro alternatives［J］.Environ Health Perspect，1998，106(Suppl 2):505-510.

［21］Bal-Price AK，Hogberg HT，Buzanska L，Lenas P，van Vliet E，Hartung T.In vitro developmental neurotoxicity(DNT)testing:relevant models and endpoints［J］.Neurotoxicology，2010，31(5):545-554.

［22］Betts KS.Growing knowledge:using stem cells to study developmental neurotoxicity［J］.Environ Health Perspect，2010，118(10):A432-A437.

［23］Breier JM，Radio NM，Mundy WR，Shafer TJ.Development of a high-throughput screening assay for chemical effects on proliferation and viability of immortalized human neural progenitor cells［J］.Toxicol Sci，2008，105(1):119-133.

［24］Breier JM，Gassmann K，Kayser R，Stegeman H，De Groot D，F(xiàn)ritsche E，et al.Neural progenitor cells as models for highthroughput screens of developmental neurotoxicity:state of the science［J］.Neurotoxicol Teratol，2010，32(1):4-15.

［25］Bal-Price AK，Hogberg HT，Buzanska L，Coecke S.Relevance of in vitro neurotoxicity testing for regulatory requirements:challenges to be considered［J］.Neurotoxicol Teratol，2010，32(1):36-41.

［26］Peterson RT，Nass R，Boyd WA，F(xiàn)reedman JH，Dong K，Narahashi T.Use of non-mammalian alternative models for neurotoxicological study［J］.Neurotoxicology，2008，29(3):546-555.

［27］Williams FE，White D，Messer WS.A simple spatial alternation task for assessing memory function in zebrafish［J］.Behav Processes，2002，58(3):125-132.

［28］Fan CY，Cowden J，Simmons SO，Padilla S，Ramabhadran R.Gene expression changes in developing zebrafish as potential markers for rapid developmental neurotoxicity screening［J］.Neurotoxicol Teratol，2010，32(1):91-98.

［29］Ton C，Lin Y，Willett C.Zebrafish as a model for developmental neurotoxicity testing［J］.Birth Defects Res A Clin Mol Teratol，2006，76(7):553-567.

［30］Rodríguez F，López JC，Vargas JP，Broglio C，Gómez Y，Salas C.Spatial memory and hippocampal pallium through vertebrate evolution:insights from reptiles and teleost fish［J］.Brain Res Bull，2002，57(3-4):499-503.

［31］Selderslaghs IW，Hooyberghs J，De Coen W，Witters HE.Locomotor activity in zebrafish embryos:a new method to assess developmental neurotoxicity［J］.Neurotoxicol Teratol，2010，32(4):460-471.

［32］Lein P，Silbergeld E，Locke P，Goldberg AM.In vitro and other alternative approaches to developmental neurotoxicity testing(DNT)［J］.Environ Toxicol Pharmacol，2005，19(3):735-744.

［33］Yang D，Lauridsen H，Buels K，Chi LH，La Du J，Bruun DA，et al.Chlorpyrifos-oxon disrupts zebrafish axonal growth and motor behavior［J］.Toxicol Sci，2011，121(1):146-159.

［34］Powers CM，Levin ED，Seidler FJ，Slotkin TA.Silver exposure in developing zebrafish produces persistent synaptic and behavioral changes［J］.Neurotoxicol Teratol，2011，33(2):329-332.

［35］Padilla S，MacPhail R.Using zebrafish to assess developmental neurotoxicity［M］∥Gupta RC.Reproductive and Developmental Toxicology.Waltham:Academic Press，2011:179-191.

［36］Huang H，Huang C，Wang L，Ye X，Bai C，Simonich MT，et al.Toxicity，uptake kinetics and behavior assessment in zebrafish embryos following exposure to perfluorooctanesulphonicacid(PFOS)［J］.Aquat Toxicol，2010，98(2):139-147.

［37］Coecke S，Goldberg AM，Allen S，Buzanska L，Calamandrei G，Crofton K，et al.Workgroup report:incorporating in vitro alternative methods for developmental neurotoxicity into international hazard and risk assessment strategies［J］.Environ Health Perspect，2007，115(6):924-931.

［38］Radio NM，Mundy WR.Developmental neurotoxicity testing in vitro:models for assessing chemical effects on neurite outgrowth［J］.Neurotoxicology，2008，29(3):361-376.