布魯氏菌為革蘭氏染色陰性的胞內(nèi)寄生菌，根據(jù)其生物學(xué)特性和侵襲宿主的傾向性可分為7個(gè)型：即馬耳他布魯氏菌（B.melitensis）、流產(chǎn)布魯氏菌（B.abortus）、豬布魯氏菌（B.suis）、綿羊布魯氏菌（B.ovis）、犬布魯氏菌（B.canis）、沙林鼠布魯氏菌（B.neotomae）和水生哺乳動(dòng)物布魯氏菌（B.maris）［1］。布魯氏菌感染動(dòng)物主要表現(xiàn)為睪丸炎、不孕不育；人類主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)痛、波浪熱、肝脾腫大、多汗、神經(jīng)痛等癥狀［2］，給養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展、人類健康和動(dòng)物性食品安全帶來(lái)很大威脅。

病原菌的致病力包括產(chǎn)生毒素（內(nèi)、外毒素）的能力、侵入宿主機(jī)體的能力（粘附力和侵襲力等）以及在宿主體內(nèi)的生存繁殖能力（包括細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外）。布魯氏菌不能產(chǎn)生外毒素，沒(méi)有質(zhì)粒、鞭毛、菌毛，不形成芽孢，有毒力的菌株可帶菲薄的莢膜。布魯氏菌缺乏這些經(jīng)典的致病因子，但是該菌卻具有較強(qiáng)的侵襲力，并且在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存繁殖能力極強(qiáng)，因此布魯氏菌的相關(guān)毒力因子的研究一直是布病病原學(xué)中重要問(wèn)題之一。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，目前己知的布魯氏菌毒力基因有：virB（IV型分泌系統(tǒng)）、控制脂多糖合成的基因、H2O2酶基因（抗氧化作用）、groE（高免疫性蛋白基因）、htrA（耐高溫基因）、dnaK（壓力蛋白基因）、SOD（超氧歧化酶基因）、rec（重組調(diào)節(jié)基因）、omp25、BvrR/Bvrs雙組分調(diào)控蛋白基因等。

細(xì)菌的分泌系統(tǒng)能將部分蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)外環(huán)境，這些被分泌的蛋白成為細(xì)菌獲得營(yíng)養(yǎng)的重要手段。對(duì)于致病性細(xì)菌而言，這些分泌性的蛋白幫助細(xì)菌發(fā)揮定殖、吸附等作用，還可以調(diào)理宿主細(xì)胞，逃逸宿主的免疫機(jī)制等［3］。根據(jù)革蘭氏陰性細(xì)菌分泌蛋白途徑的不同，可以將分泌系統(tǒng)分為6類：I—IV分泌系統(tǒng)、自轉(zhuǎn)運(yùn)分泌系統(tǒng)（autotransporter secretion）和兩步轉(zhuǎn)運(yùn)分泌系統(tǒng)（two－partner secretion，TPS），有時(shí)又將后兩個(gè)分泌系統(tǒng)統(tǒng)稱為V型分秘系統(tǒng)。IV型分泌系統(tǒng)可以轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)和/或DNA和/或蛋白復(fù)合物［5－6］，該系統(tǒng)由11個(gè)不同的蛋白組成，跨越細(xì)胞膜建立一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)的通道，通過(guò)一個(gè)類鞭毛樣的結(jié)構(gòu)與靶細(xì)胞接和，使分泌的蛋白到達(dá)靶細(xì)胞。轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程一步完成，在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中需要ATP提供能量［7］。目前已在百日咳桿菌、幽門螺旋菌、軍團(tuán)桿菌中證實(shí)了該分泌系統(tǒng)的存在。

通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)，B.melitensis的virB可以影響胞內(nèi)生存相關(guān)蛋白的表達(dá)［4］。

B.melitensis 16MΔvirB突變株在感染細(xì)胞時(shí)，喪失了在胞內(nèi)生存、復(fù)制的能力，當(dāng)與野生株共同感染細(xì)胞時(shí)，ΔvirB突變株獲得了逃逸宿主細(xì)胞攻擊的能力［10］。將B.abortus的virB 基因敲除后，使感染小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答水平降低［19］?？梢?jiàn)virB通過(guò)影響宿主細(xì)胞的一些基因的表達(dá)及改變信號(hào)通路，來(lái)調(diào)節(jié)布魯氏菌在宿主細(xì)胞的生存，virB對(duì)于布魯氏菌的胞內(nèi)持續(xù)生存發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是布魯氏菌的重要毒力基因。

1 布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)（Type IV secretion system，TFSS）的發(fā)現(xiàn)

布魯氏菌的TFSS最初是通過(guò)轉(zhuǎn)座子TnblaM發(fā)現(xiàn)的，在B.suis的基因組中隨機(jī)插入轉(zhuǎn)座子使該菌失去了在Hela細(xì)胞和巨噬細(xì)胞生存和復(fù)制的能力。在其中的一個(gè)致弱株中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子所插入的該段基因與以農(nóng)桿菌的virB9和virB10編碼區(qū)、百日咳桿菌的ptlH和ptlG編碼區(qū)有著較高的同源性。通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)這段12kb大小的編碼區(qū)與以農(nóng)桿菌的11個(gè)virB蛋白區(qū)具有同源性。后來(lái)，隨著B.abortus 2308基因組計(jì)劃的完成發(fā)現(xiàn)了TFSS完整的啟動(dòng)子［8］。布魯氏菌的TFSS是一個(gè)含有11個(gè)可跨越細(xì)菌膜的多蛋白復(fù)合物，由virB操縱子編碼，與布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)生存、復(fù)制有密切關(guān)系［9－10］。virB 在B.melitensis、B.abortus 和 B.ovis中持續(xù)表達(dá)［11］。

2 virB區(qū)的結(jié)構(gòu)

virB 區(qū)有12個(gè)開放閱讀框（ORF），virB1－11與以農(nóng)桿菌的virB蛋白編碼區(qū)同源。virB12由172個(gè)氨基酸組成，蛋白大小19kD，切除預(yù)測(cè)的信號(hào)肽序列后大小為17.5kD，含有脂蛋白序列（13～16位為L(zhǎng)AAC殘基），virB12與以農(nóng)桿菌等的virB蛋白編碼區(qū)沒(méi)有同源性［12］。但virB12與rhizosphere（一種根際微生物）的兩個(gè)質(zhì)粒pSB102和pIPO2T有著高度的同源性［12］，并且virB12對(duì)于布魯氏菌的致病力是必需的［8］。通過(guò)Northern blotting表明，virB區(qū)由同一啟動(dòng)子調(diào)控［8］。

3 virB區(qū)對(duì)布魯氏菌毒力的影響

virB對(duì)于B.melitensis、B.abort us、B.suis在細(xì)胞內(nèi)生存和繁殖是非常重要的［13－14］，缺失virB區(qū)基因的所有突變株都失去了在細(xì)胞內(nèi)繁殖的能力［8，15］。統(tǒng)計(jì)了最近所有的毒力致弱突變株，發(fā)現(xiàn)大約有25%的毒力致弱株都是由于缺失了virB區(qū)基因，可見(jiàn)virB系統(tǒng)在布魯氏菌的致病力上發(fā)揮著非常重要的作用。

細(xì)胞內(nèi)寄生的病原菌入侵機(jī)體后，首先被吞噬細(xì)胞吞噬形成吞噬小體，然后溶酶小體與吞噬小體形成融合小體，以此來(lái)消化病原菌。布魯氏菌在感染宿主后被宿主的吞噬細(xì)胞吞噬，形成布氏小體（Brucella－containing vacuole，BCV）［16］，在 TFSS的參與下，能有效地阻止溶酶小體與BCV融合，致使布魯氏菌能在吞噬細(xì)胞中生存［17］。隨后，通過(guò)依賴于TFSS的途徑，BCV可持續(xù)的與網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（Endoplasmic Reticulum，ER）相互作用，導(dǎo)致ER膜在BCV的積聚，使BCV獲得ER的特性，從而逃逸宿主的免疫機(jī)制。而TFSS缺陷的布魯氏菌不能調(diào)控BCV與ER發(fā)生相互作用，BCV處于中間、未成熟狀態(tài)，最終與溶酶體融合，導(dǎo)致降解。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，TFSS主要在調(diào)控布魯氏菌從BCV到ER的胞內(nèi)運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)揮作用，一旦布魯氏菌到達(dá)其復(fù)制部位，該分泌系統(tǒng)即被關(guān)閉。不過(guò)，TFSS是如何調(diào)控布魯氏菌的胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)娜圆磺宄?/p>

4 virB操縱子的調(diào)控

利用綠色熒光蛋白（GFP）作為報(bào)告基因來(lái)檢測(cè)virB操縱子在B.suis內(nèi)的轉(zhuǎn)錄情況。GFP被插入到virB1基因上游。當(dāng)布魯氏菌在TSA或TSB培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)時(shí)，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)；當(dāng)該菌感染J774巨噬細(xì)胞或Hela細(xì)胞時(shí)，經(jīng)檢測(cè)在感染后3h即可看到胞內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)［8］。

將布魯氏菌在不同條件下培養(yǎng)，提取菌體總RNA，以此來(lái)分析是什么因素影響virB操縱子轉(zhuǎn)錄的。研究發(fā)現(xiàn)，在成分豐富的培養(yǎng)基中，virB操縱子轉(zhuǎn)錄水平非常低；培養(yǎng)基成分比較貧瘠時(shí)，virB操縱子卻處于較高的轉(zhuǎn)錄水平。研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)菌處于不同的生長(zhǎng)周期，virB轉(zhuǎn)錄的水平也不同。當(dāng)細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期早期時(shí)，virB的轉(zhuǎn)錄水平最高；當(dāng)細(xì)菌處于復(fù)制的后期和靜止期時(shí)，virB的轉(zhuǎn)錄水平比較低。碳源對(duì)于virB的轉(zhuǎn)錄水平影響也是非常重要的，在有葡萄糖、半乳糖和琥珀酸鹽存在時(shí)，virB轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)；布魯氏菌在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的其他碳源，像樹膠醛糖、戊醛糖、赤藻糖醇存在時(shí)，對(duì)virB轉(zhuǎn)錄沒(méi)有刺激作用。virB轉(zhuǎn)錄還受溫度的影響，在37℃比在20℃的轉(zhuǎn)錄水平要高。Lin和Ficht（1995年）發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌處于pH4條件下3 h，該菌蛋白的合成水平顯著降低，但virB操縱子轉(zhuǎn)錄水平顯著提高。這些現(xiàn)象存在于B.suis和B.melitensis菌內(nèi)。在B.abort us 2308菌株內(nèi)virB操縱子的調(diào)控與B.suis和B.melitensis不同［18］，研究發(fā)現(xiàn)virB操縱子的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在含有豐富培養(yǎng)基成分，發(fā)生在復(fù)制周期的衰退期。

Francoise Porte等人的研究表明，含有布魯氏菌的吞噬小體在pH達(dá)到4h，即很快的酸化，這種酸化對(duì)于B.suis的繁殖是必需的。如果吞噬小體的酸化環(huán)境，在最初感染的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)被氯化氨中和，或被藥物抑制時(shí)，布魯氏菌的復(fù)制也被阻斷了［19］。當(dāng)細(xì)胞在感染布魯氏菌之前，用氯化氨等預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)感染后virB操縱子的轉(zhuǎn)錄停止?？梢?jiàn)吞噬小體的酸化對(duì)于virB操縱子的轉(zhuǎn)錄是必需的［9］。

布魯氏菌的基因組雖已被破譯，但布魯氏菌基因組編碼的大多數(shù)蛋白的功能尚未確定，特別是分泌蛋白的研究。楊羽等人使用6種軟件預(yù)測(cè)布魯氏菌16M菌株的分泌蛋白［22］，得到具有信號(hào)肽的蛋白191個(gè)。但使用的軟件、算法不同，可能得出的結(jié)果也會(huì)不同；并且利用生物信息學(xué)方法得出的結(jié)果可能會(huì)和試驗(yàn)的結(jié)果有一定的差異。還有利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法從全基因組角度研究布魯氏菌分泌蛋白的［23］，但有些分泌蛋白只有在侵入到宿主細(xì)胞時(shí)，發(fā)揮致病性時(shí)，才會(huì)分泌出來(lái)；而且由于細(xì)菌較易裂解，因而從細(xì)胞培養(yǎng)物上清中獲得的分泌蛋白可能會(huì)存在著一些釋放到其中的菌體蛋白，因而通過(guò)該方法得到的蛋白不能都確定為分泌蛋白。張沾等人通過(guò)對(duì)IV型分泌系統(tǒng)效應(yīng)子VceC的研究表明VceC在侵染胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞過(guò)程中具有毒性作用［24］。王玉飛等人通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)virB操縱子通過(guò)影響相關(guān)蛋白的功能，包括VjbR，DnaK，HtrA，Omp25和GntR，來(lái)調(diào)節(jié)布魯氏菌的胞內(nèi)生存；并且T4SS影響外膜蛋白的特性，這可能與布魯氏菌適應(yīng)胞內(nèi)、外的生存環(huán)境是緊密相關(guān)的［25－26］。

布魯氏菌是一種胞內(nèi)寄生菌，在巨噬細(xì)胞中生存和繁殖是布魯氏菌致病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，TFSS與布魯氏菌的胞內(nèi)生存密切相關(guān)，但是TFSS如何影響或調(diào)控該過(guò)程還不清楚。有關(guān)TFSS的研究主要集中在分析TFSS在布魯氏菌胞內(nèi)運(yùn)輸、生存和復(fù)制方面是如何發(fā)揮作用的［20－21］，這些機(jī)制的逐步闡明對(duì)于布魯氏菌病的控制和凈化將發(fā)揮重要作用。

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