王澤慧，邊云飛，肖傳實(shí)

血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的異常增殖是高血壓血管重構(gòu)以及血管增殖性疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、經(jīng)皮腔冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)（PCI）后再狹窄、血管移植術(shù)后新生內(nèi)膜增生等發(fā)生發(fā)展的主要病理基礎(chǔ)。

microRNA可以調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)。近年來發(fā)現(xiàn)miR－145是正常動(dòng)脈中含量最豐富的miRNA，且主要聚集在VSMC［1］。miR－145在原代培養(yǎng)的VSMC中含量最豐富而在去分化的VSMC中的表達(dá)是下調(diào)的［2］。本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)成功構(gòu)建了大鼠miR－145重組慢病毒載體并在去分化型VSMC中過表達(dá)，但是miR－145是否能抑制去分化型VSMC增殖及其機(jī)制仍不清楚。故本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的大鼠原代VSMC為模型，應(yīng)用PDGF－BB作為外界刺激因子誘導(dǎo)VSMC增殖，同時(shí)用構(gòu)建好的大鼠miR－145重組慢病毒載體浸染目的細(xì)胞，CCK－8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，并在分子水平探討miR－145是否通過抑制PDGF激活MAPK途徑從而抑制VSMC增殖，從而為其抑制VSMC增殖的作用機(jī)制提供新的思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料 山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供健康SD大鼠，體重110g～130g；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclone公司；PDGF－BB購自美國PEPROTECH公司；CCK－8試劑購自碧云天公司；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT－PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司；引物設(shè)計(jì)與合成由上海吉瑪公司完成；蛋白提取試劑盒購自北京普利萊公司；PVDF膜購自北京索萊寶公司；磷酸化ERK1／2和總ERK1／2抗體購自北京博奧森公司；磷酸化JNK和總JNK抗體、磷酸化p38MAPK和總p38MAPK抗體均購自美國Cell signaling technology公司；羊抗兔二抗購自Santa公司；marker購自富酶泰斯生物技術(shù)（深圳）有限公司；Ecl－plus發(fā)光試劑盒購自武漢博士德公司；其他試劑均系進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1．2 方法

1．2．1 大鼠原代VSMC培養(yǎng) 采用組織塊貼壁法培養(yǎng)VSMC，傳代后對(duì)VSMC進(jìn)行抗αSM－actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。選擇3～8代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．2．2 實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞分為4組。空白對(duì)照組：培養(yǎng)的大鼠原代VSMC不做任何處理。PDGF－BB組：大鼠原代VSMC中加 入 終 濃 度 為 10g／mLPDGF－BB。PDGF－BB＋ miR－145組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR－1 4 5慢病毒載體7 2h后加入終濃度為1 0 g／mLDGF－BB。miR－NC組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性慢病毒載體。

1．2．3 CCK－8法測(cè)細(xì)胞增殖 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞種96孔板，每孔加入100μL細(xì)胞，邊緣孔用無菌PBS填充，加入各組中的藥物及慢病毒，每孔100μL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。5%CO2，37℃孵育48h。每孔加入10μLCCK－8溶液繼續(xù)培養(yǎng)1h～4h。酶標(biāo)儀在450nm波長處測(cè)每孔的光密度值。

1．2．4 細(xì)胞RNA提取和RT－PCR反應(yīng) 使用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到對(duì)應(yīng)細(xì)胞的cDNA模板，采用SYBR Green法進(jìn)行Real－time PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為20 μL，包含上下游引物、DNA 模板、Taq DNA polymerase和ddH2O。定量反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火31s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。各組PCR均重復(fù)3次。使用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。mRNA的相對(duì)表達(dá)量用2－△△Ct方法來表示，其中△Ct＝Ct目標(biāo)mRNA－CtGAPDH，△△Ct＝△Ct處理－△Ct對(duì)照。

1．2．5 Western印跡方法檢測(cè) ERK1／2 和 p－ERK1／2等的表達(dá) 用Bradford法測(cè)蛋白濃度。5%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜（PVDF膜），依次加入兔抗鼠ERK1／2和p－ERK1／2抗體（1∶2 00）、兔抗鼠JNK和p－JNK抗體（1∶2 000）、兔抗鼠p38MAPK和p－p38MAPK（1∶2 000）浸泡濾膜，4℃過夜，洗滌后加入堿磷酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶3 000），洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)。定量分析采用分子生物學(xué)圖像分析系統(tǒng)。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13．0軟件，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2．1 miR－145對(duì)PDGF誘導(dǎo)VSMC增殖的影響 CCK－8結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，miR－NC組OD值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PDGF組OD值明顯升高（P＜0．05），PDGF可促進(jìn)VSMC增殖。與PDGF－BB組比較，PDGF－BB＋miR－145組OD值明顯下降（P＜0．05），提示miR－145可抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMC增殖。詳見表1。

表1 miR－145對(duì)VSMC增殖影響的CCK－8結(jié)果（±s）

表1 miR－145對(duì)VSMC增殖影響的CCK－8結(jié)果（±s）

組別 CCK－8（OD）空白組0．855±0．062 miR－NC組 0．777±0．058 PDGF－BB＋miR－145組 0．545±0．0351）PDGF－BB組 1．374±0．0861）2）與空白組比較，1）P＜0．05；與PDGF－BB＋miR－145組相比，2）P＜0．05

2．2 miR－145對(duì)VSMC相關(guān)基因的影響 RT－PCR結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，miR－NC組PCNA、c－Jun及SM22amRNA的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PDGF組PCNA、c－Jun mRNA的表達(dá)分別上調(diào)1．37倍和2．68倍（P＜0．05），而SM22amRNA的表達(dá)下調(diào)80%（P＜0．05）。提示PDGF可促進(jìn) VSMC增殖抑制VSMC分化；與 PDGF－BB組比較，PDGF－BB＋miR－145組 PCNA、c－Jun mRNA 的表達(dá)分別下調(diào)66．4%和77．2%（P＜0．05），而SM22amRNA 的表達(dá)上調(diào)4．4倍（P＜0．05）。提示miR－145可抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMC增殖而促進(jìn)VSMC分化。

2．3 miR－145對(duì)PDGF誘導(dǎo)的p－ERK／ERK 蛋白表達(dá)的影響

Western－blot結(jié)果顯示：PDGF－BB（10ng／mL）誘導(dǎo) VSMC后，p－ERK水平明顯上調(diào)，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。轉(zhuǎn)染 miR－145干預(yù)72h后再加入 PDGF－BB刺激，p－ERK水平明顯下調(diào)，與PDGF組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。空質(zhì)粒組與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見圖1。

圖1 miR－145對(duì)PDGF誘導(dǎo)的p－ERK／ERK蛋白表達(dá)的影響

2．4 miR－145對(duì)PDGF誘導(dǎo)的p－JNK／JNK蛋白表達(dá)的影響Western－blot結(jié)果顯示：PDGF－BB（10ng／mL）誘導(dǎo) VSMC后，p－JNK水平明顯上調(diào)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。轉(zhuǎn)染 miR－145干預(yù)72h后再加入PDGF－BB刺激，p－JNK 水平明顯下調(diào)，與PDGF組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）?？召|(zhì)粒組與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見圖2。

圖2 miR－145對(duì)PDGF誘導(dǎo)的p－JNK／JNK蛋白表達(dá)的影響

2．5 miR－145對(duì) PDGF 誘導(dǎo)的 p－p38MAPK／p38MAPK 蛋白 表 達(dá) 的 影 響 Western－blot結(jié) 果 顯 示 ：PDGF－BB（1 0 ng／mL）誘導(dǎo)VSMC后，p－p38MAPK水平明顯上調(diào)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。轉(zhuǎn)染miR－145干預(yù)72h后再加入PDGF－BB刺激，p－p38MAPK水平明顯下調(diào)，與PDGF組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）?？召|(zhì)粒組與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見圖3。

圖3 miR－145對(duì)PDGF誘導(dǎo)的p－p38MAPK／p38MAPK蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

VSMC由分化表型向去分化表型轉(zhuǎn)化是VSMC增殖與遷移的關(guān)鍵性起始步驟，這是許多血管增生性疾病如：動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）術(shù)后再狹窄等疾病共同的細(xì)胞病理基礎(chǔ)之一。microRNA是近些年來研究的熱點(diǎn)之一，而miR－145受到關(guān)注是由于它在許多癌癥中的表達(dá)下調(diào)，能夠抑制癌細(xì)胞增殖，是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因［3，4］。然而，miR－145能否抑制VSMC的增殖仍不清楚。miR－145是VSMC一個(gè)重要的表性標(biāo)記物和表型調(diào)節(jié)劑，能夠抑制新生內(nèi)膜的形成［1］。但是抑制新生內(nèi)膜形成的具體機(jī)制尚未闡明。因此，進(jìn)一步研究miR－145抑制VSMC增殖的機(jī)制是本次研究的重點(diǎn)。

細(xì)胞增殖是一系列基因有序調(diào)控的結(jié)果，在許多病理情況下，外界環(huán)境造成某些生長因子（如PDGF）增多，通過刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)某些基因表達(dá)增多，使VSMC的增殖失控，引起一系列病理改變［5］。MAPK是刺激脊柱類動(dòng)物細(xì)胞增殖、分化的信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)傳遞的交匯點(diǎn)或共同通路［6，7］。PDGF能夠吸引血管中層平滑肌向內(nèi)膜下遷移，使VSMC從收縮型變?yōu)楹铣尚?，合成型（即去分化型）VSMC有很強(qiáng)的增殖能力及更高的MAPK水平［8］。PDGF通過受體酪氨酸酶途徑激活靜止期VSMC的 MAPK［9］，MAPK 激活轉(zhuǎn)錄因子，增加 VSMC的DNA合成，促進(jìn)細(xì)胞增殖［10］。miR－145能否通過抑制去分化型VSMC中的MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而抑制VSMC的增殖尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)測(cè)CCK－8比較PDGF組和轉(zhuǎn)染miR－145慢病毒載體再給PDGF組的VSMC增殖情況；RT－PCR說明miR－145抑制增殖的機(jī)制與VSMC相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)；同時(shí)做western blot說明miR－145抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMC增殖的機(jī)制與其抑制MAPK通路中的p－ERK／ERK、p－JNK／JNK、p－p38MAPK／p38MAPK蛋白的表達(dá)有關(guān)。

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