李媛 綜述 宋麗華 審校

目前肺癌已成為全世界最常見的惡性腫瘤，其死亡率已居世界首位。肺癌中約80%-85%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），手術(shù)是治療肺癌最有效的方法，但是大多數(shù)患者在確診時已為晚期期而失去手術(shù)機會。以鉑類為基礎(chǔ)的化療藥物對NSCLC的治療療效雖有提高，然而這種療法似乎進入了一個平臺期，無法滿足進展期NSCLC的治療需要。近年來，腫瘤分子靶向治療成為全球研究的熱點之一，以吉非替尼（gefitinib, iressa）和厄洛替尼（erlotinib, tarceva）為代表的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）在NSCLC治療中發(fā)揮了重要作用。但是在臨床中，有些患者對EGFR-TKIs的治療并不敏感，或開始對該類藥物高度敏感但經(jīng)過約10個月-14個月[1,2]的中位無疾病進展生存期（progression free survival, PFS）后最終產(chǎn)生耐藥，使該類藥物的臨床應(yīng)用受到一定限制。闡明EGFR-TKIs的有效機制、原發(fā)性耐藥機制和治療有效后的繼發(fā)性耐藥（獲得性耐藥）機制，將有助于高選擇性個體化治療，為克服或逆轉(zhuǎn)耐藥提供新思路。本文將對近年來EGFRTKIs耐藥機制的研究進展作一綜述。

1 EGFR結(jié)構(gòu)及功能

EGFR是跨膜受體酪氨酸激酶家族的一員，該家族共4個成員，包括HER1（erbB1, EGFR）、HER2（erbB2）、HER3（erbB3）及HER4（erbB4），由3個不同的結(jié)構(gòu)區(qū)組成，包括胞外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)。EGFR可以與特異性配體如表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子α（transforming growth factor α, TGF-α）、雙向調(diào)節(jié)蛋白（AR）等結(jié)合形成同源二聚體，也可以和HER2或其它家族成員形成異源二聚體。二聚體的形成使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致酪氨酸激酶（tyrosine kinase, TK）激活及受體自動磷酸化，從而激活下游一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如Ras-Raf-MAPK途徑、PI3K-Akt途徑和STAT途徑。EGFR信號通路在細胞的生長、增殖和分化等生理過程中發(fā)揮重要的作用，而在一些腫瘤細胞中EGFR常過表達，與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移、侵潤、預(yù)后差有關(guān)。

2 EGFR突變與EGFR-TKIs作用機制

肺癌中EGFR突變主要發(fā)生在胞內(nèi)酪氨酸激酶編碼區(qū)（18-21外顯子），這些突變多存在于ATP結(jié)合裂隙附近，而該位點正是吉非替尼結(jié)合的靶位。其中最常見的有2種突變形式，占目前所有檢測出來突變的80%-90%，分別為：①19外顯子第746-750位密碼子的缺失突變，導(dǎo)致EGFR蛋白中氨基酸序列丟失，改變了受體ATP結(jié)合囊角度；②21外顯子點突變（L858R），此突變位點緊鄰激酶活化環(huán)中高度保守的模體，兩種突變均明顯增強了腫瘤細胞對EGFR-TKIs的敏感性。臨床研究顯示：亞裔、女性、非吸煙、腺癌患者對EGFR-TKIs顯示較好的療效，且與EGFR突變分布一致。EGFR突變后對TKIs的反應(yīng)率增高的可能解釋有2種，一種是癌基因依賴學(xué)說，EGFR突變的腫瘤對EGFR這條信號通路高度依賴，所以阻斷這條通路對腫瘤生長影響很大，從而提高了抗腫瘤藥物的療效。另一種可能是突變導(dǎo)致關(guān)鍵氨基酸殘基重新分布，使得EGFR不管與ATP還是TKIs結(jié)合都更為緊密，這可以解釋突變的EGFR與配體結(jié)合酪氨酸激酶活性增強，同時與TKIs結(jié)合后TK活性抑制也較強。

3 EGFR-TKIs耐藥機制

3.1 原發(fā)性耐藥 原發(fā)性耐藥即腫瘤細胞在治療初期就對TKIs治療無明顯反應(yīng)，應(yīng)用該藥物治療后病情未得到緩解，臨床未明顯獲益。EGFR基因的突變率因種族的不同而不同，在亞洲NSCLC患者中高達20%-30%，而在高加索NSCLC患者中為10%-15%[3]。臨床研究[4]證實，EGFR突變陽性的NSCLC對吉非替尼或厄洛替尼的治療有效率為70%-80%，而野生型患者的有效率僅約10%-20%，因而，不少患者對EGFR-TKIs治療存在著原發(fā)性耐藥，而EGFR不同的基因狀態(tài)可能存在著不同的原發(fā)性耐藥機制。研究顯示某些EGFR突變也可以引起NSCLC對EGFR-TKIs耐藥，如治療前存在EGFR 20外顯子插入突變提示原發(fā)性耐藥[5]，其機制可能是由于突變形成了空間位阻，使吉非替尼及厄洛替尼無法與TKs區(qū)結(jié)合，大大地降低了藥物的敏感性。

但是上述突變較少見，只能對原發(fā)性耐藥做出部分解釋。EGFR突變的NSCLC對EGFR信號通路高度依賴，稱為EGFR依賴或成癮，當應(yīng)用EGFR抑制劑時，這些通路被關(guān)閉而發(fā)生凋亡，然而EGFR野生型的NSCLC中沒有此EGFR依賴來調(diào)控下游信號通路，可能伴有其它信號通路的異常，因此對EGFR-TKIs不敏感。研究[6]發(fā)現(xiàn)大約有10%-30%的NSCLC患者存在KRAS基因突變，這些突變與吸煙之間具有很強的相關(guān)性，而EGFR突變卻常常發(fā)生在非吸煙者的亞裔患者中，這些數(shù)據(jù)說明KRAS和EGFR突變很少同時出現(xiàn)在同一類型的腫瘤中。另有研究[7]顯示KRAS突變與EGFR突變互相排斥，也就是說該突變大多存在于EGFR野生型腫瘤，這可能是導(dǎo)致EGFRTKIs原發(fā)性耐藥的另一重要機制。KRAS基因突變主要發(fā)生于第12、13位密碼子，這兩種密碼子主要發(fā)生G-T顛換，突變的結(jié)果導(dǎo)致編碼的氨基酸發(fā)生改變，持續(xù)性激活EGFR非依賴性信號通路，導(dǎo)致瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移以及凋亡抵抗，進而對EGFR-TKIs產(chǎn)生原發(fā)性耐藥。KRAS突變在高加索人群NSCLC患者的突變率較高[8]，尤其是在肺腺癌患者中突變率達30%-50%，而EGFR的突變率較低（3%-8%），這可能是高加索人群對TKIs原發(fā)性耐藥發(fā)生率較高。BR.21安慰劑對照試驗[9]對KRAS與EGFR基因型對厄洛替尼治療效果的影響進行了評估，結(jié)果顯示，KRAS野生型患者（HR=0.69, P=0.03）可從厄洛替尼治療中獲得統(tǒng)計學(xué)意義上的生存益處，而KRAS突變型（HR=1.67, P=0.31）生存獲益則未達到統(tǒng)計學(xué)意義。Sasaki等[10]分析研究了172例日本NSCLC患者的KRAS突變及其基因拷貝數(shù)的聯(lián)系，以及與生存期的關(guān)系，結(jié)果顯示僅KRAS突變與肺癌患者的生存期有關(guān)，KRAS突變及其基因拷貝數(shù)增加導(dǎo)致患者預(yù)后不良。因此，以上研究提示KRAS基因突變與肺癌患者對EGFR-TKIs的原發(fā)耐藥有關(guān)，利用KRAS基因檢測可以為TKIs藥物治療病人的篩選提供重要參考。

KRAS信號途徑的其它信號分子可能與EGFR-TKIs的原發(fā)耐藥有關(guān)，如BRAF（Raf亞型）突變。BRAF基因是RAF家族的成員之一，該家族還包括ARAF和RAF1。BRAF編碼一種絲/蘇氨酸特異性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，參與調(diào)控細胞內(nèi)多種生物學(xué)過程，如細胞增殖、分化和凋亡等，與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。研究表明約3%的NSCLC存在BRAF突變，最常見的BRAF突變發(fā)生在BRAF激酶區(qū)活性部分的600位，由谷氨酸取代了纈氨酸（V600E），突變可激活MEK-ERK信號傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細胞增殖和分化。BRAF突變的NSCLC對EGFR信號通路缺乏依賴性，故對EGFRTKIs有耐藥性，而對MEK抑制劑敏感[11]。因此，應(yīng)用靶向BRAF及整個RAF家族或它的效應(yīng)器（如MEK）的藥物，可對部分BRAF突變患者臨床獲益。

另外有研究[12]結(jié)果表明，棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣4（EML4）/間變淋巴瘤激酶（ALK）融合基因（EML4-ALK融合基因）與TKIs耐藥有關(guān)，約3%-5%的NSCLC患者可發(fā)現(xiàn)EML4-ALK基因重排，EML4-ALK基因重排常導(dǎo)致異常酪氨酸激酶表達。2009年Shaw等[13]分析了141例NSCLC患者EML4-ALK的突變情況，發(fā)現(xiàn)19例患者存在EML4-ALK突變（13%），這些多為不吸煙或輕度吸煙及腺癌患者，且EML-ALK陽性患者通常對TKIs治療無效。因此需要轉(zhuǎn)變對這部分患者的治療策略，例如針對ALK的靶向治療。

EGFR-TKIs原發(fā)性耐藥也可能與非突變機制介導(dǎo)有關(guān)。在體外實驗收集的資料[14]表明Met激活與EGFR-TKIs原發(fā)性耐藥有關(guān)，與MET原癌基因擴增是相互獨立的，實驗還發(fā)現(xiàn)在原發(fā)腫瘤患者中Met的表達及磷酸化作用是發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的高危因素。與獲得性耐藥作用不同，原發(fā)耐藥主要是由HGF激活MET通過GRB2相關(guān)結(jié)合蛋白1（GAB1）的作用激活下游信號通路[15]，而不是ErbB3的作用。

3.2 EGFR-TKIs的獲得性耐藥 獲得性耐藥即在治療初期效果顯著，經(jīng)過幾個療程后對藥物反應(yīng)性下降，最終出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或進展的情況。2010年Jackman等在J Clin Oncol雜志[16]上發(fā)表了關(guān)于EGFR-TKIs獲得性耐藥的定義：①既往接受過EGFR-TKIs單藥治療（吉非替尼或厄洛替尼）；②符合以下標準之一：具有與藥物敏感性相關(guān)的EGFR基因突變（如G719X、19外顯子缺失、 L858R、L861Q）；接受EGFR-TKIs單藥治療后有客觀上的臨床獲益，包括完全緩解、部分緩解或是超過6個月的疾病穩(wěn)定（依照RECIST或WHO標準）；③接受吉非替尼或厄洛替尼連續(xù)治療至少30天后出現(xiàn)疾病進展（RECIST或WHO標準）；④停用EGFR-TKIs及開始新的治療方法之間無其它系統(tǒng)治療?，F(xiàn)有的研究顯示，約50%的EGFRTKIs獲得性耐藥與T790M突變相關(guān)，另有20%與原癌基因MET擴增相關(guān)，而一些獲得性耐藥的分子機制目前仍在研究中。

3.2.1 T790M突變 EGFR二次突變是第一個被國際上認可的引起EGFR-TKIs獲得性耐藥的機制，率先由Kobayashi等[17]2005年發(fā)表在N Engl J Med上的文章提出。該研究對1例治療前有EGFR 19外顯子敏感活化突變（del L747-S752）、接受吉非替尼二線治療達完全緩解24個月后出現(xiàn)進展的肺腺癌患者進行二次活檢，分析其活檢組織EGFR基因突變情況，發(fā)現(xiàn)在原有突變基礎(chǔ)上，EGFR基因發(fā)生了第二次突變，突變位點在20外顯子，即酪氨酸激酶活化域的790位蘇氨酸殘基被甲硫氨酸取代，從而形成位阻效應(yīng)，在空間上阻礙了吉非替尼和厄洛替尼的連接。近年來的研究[18]顯示，T790M突變增加了EGFR與ATP之間的親和力，相對削弱了與EGFR-TKIs的親和力。因此針對T790M突變導(dǎo)致TKIs耐藥的NSCLC，可給予不可逆性的多靶點抑制劑作為后續(xù)治療。

T790M突變是怎樣產(chǎn)生的呢？為了說明這一問題，2006年Inukai等[19]用一種使T790M突變富集的高敏感性PCR檢測方法，從280例未經(jīng)吉非替尼治療的NSCLC患者中發(fā)現(xiàn)9例T790M突變（3.6%），而用直接測序方法僅檢出1例，據(jù)此作者提出了假說：經(jīng)過EGFR-TKls治療后敏感腫瘤細胞被殺滅，而其有T790M突變的耐藥腫瘤細胞則被選擇性存活下來。Maheswaran等[20]通過用一種高敏感的PCR方法，對26例具有EGFR突變的NSCLC患者外周血循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell, CTC）及腫瘤組織進行了分析，有10例在血液中檢測出了具有T790M突變的腫瘤細胞（38%），且只有以很高的擴增循環(huán)數(shù)才能檢測到，發(fā)現(xiàn)該突變不僅存在于接受EGFR-TKIs治療的患者腫瘤細胞中，還存在于治療前的腫瘤組織中，突變表明PFS持續(xù)時間更短。以上研究結(jié)果表明，T790M突變在未經(jīng)EGFR-TKIs治療的腫瘤細胞中有微克隆存在，治療過程中這些克隆被選擇性富集。

3.2.2 MET擴增 原癌基因MET擴增是導(dǎo)致EGFR-TKIs獲得性耐藥性的另一重要機制。MET是肝細胞生長因子（HGF）/分散因子的一種高親和力的酪氨酸激酶受體，被激活后發(fā)生自身磷酸化，引起多種底物蛋白磷化和細胞內(nèi)一系列信號傳導(dǎo)，激活MAPK-ERK1/2及P13K-Akt等信號通路，促進多種瘤細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。2007年Engelman等[21]構(gòu)建了一株開始對吉非替尼敏感的但暴露在遞增濃度的吉非替尼6個月后產(chǎn)生對其耐藥的克隆的細胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這一耐藥歸因于MET原癌基因的擴增。研究者提出MET擴增導(dǎo)致的吉非替尼耐藥是通過以ErbB3介導(dǎo)的PI3K通路持續(xù)激活，從而繞過了受抑制的EGFR靶點而產(chǎn)生。

由于MET擴增可促進TKIs耐藥性的產(chǎn)生，多個MET抑制劑正在研究中，如HGF抗體（AMG102）、MET抗體（MetMAb）及MET小分子抑制劑（XL184、ARQ 197、SGX-523等）。其中ARQ197是一種選擇性的METTKIs，應(yīng)用于晚期NSCLC的II期臨床研究[22]顯示，厄洛替尼+ARQ197組的PFS為16.1周，而厄洛替尼+安慰劑組為9.7周。聯(lián)合EGFR-TKIs和c-MET抑制劑可能延緩耐藥，但有待進一步研究結(jié)果證實。

3.2.3 其它機制 對TKIs獲得性耐藥的患者，約30%-40%既無繼發(fā)突變，也無MET擴增，這些患者耐藥機制的研究還在進行中?？赡艿臋C制如下：

腫瘤細胞從上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition, EMT)，是生物胚胎形成和發(fā)育常見的生理過程，同時還存在于多種病理過程中，與腫瘤細胞的原位侵襲和遠處轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系。EMT以上皮標記物蛋白（如E-鈣粘蛋白、EpCAM等）的下調(diào)及間葉標記物蛋白（如波形蛋白、纖連蛋白等）的上調(diào)為特征。研究[23]發(fā)現(xiàn)，當發(fā)生EMT的肺癌重新表達E-鈣粘蛋白后，腫瘤細胞可恢復(fù)對EGFR-TKIs治療的敏感性。Yauch等[24]收集了87例化療聯(lián)合厄洛替尼治療后復(fù)發(fā)的肺癌患者，對其中的65例進行分析后發(fā)現(xiàn)，E-鈣粘蛋白高表達的患者PFS更長（HR=0.37），而對厄洛替尼不敏感的肺癌組織往往合并波形蛋白和（或）纖連蛋白等標記物的表達。以上研究提示EMT狀態(tài)可作為預(yù)測EGFRTKIs療效的潛在因素，這仍需進一步研究確定是否有臨床意義[25,26]。

胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R）是一種跨膜蛋白，在致癌性轉(zhuǎn)化、腫瘤細胞生長和存活起到非常重要的作用。有研究[27]指出，EGFR-TKIs可誘導(dǎo)NSCLC細胞膜表面EGFR/IGF1R異源二聚體化進而激活I(lǐng)GF-1R及其下游信號通路MAPK和P13K/AKT的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并能刺激mTOP介導(dǎo)的survivin蛋白合成引發(fā)抗凋亡效應(yīng)，從而引起肺癌患者對TKIs耐藥。 另一項體外研究[28]顯示，對吉非替尼耐藥的細胞株中，IGF結(jié)合蛋白3（IGFBP3）及IGF結(jié)合蛋白4（IGFBP4）表達下調(diào)，與IGF-1R及其下游信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活有關(guān)。EGFR高表達的樣本中也伴隨著IGFR-1的高表達，因此EGFR和IGF-1R雙靶點抑制劑可作為潛在的治療策略。

另外EGFR-TKIs獲得性耐藥也與以下幾個方面有關(guān)：①研究發(fā)現(xiàn)PTEN基因表達喪失可活化PI3K/Akt/mTOR信號通路，導(dǎo)致凋亡抵抗，促進癌癥的發(fā)生，進而對EGFR-TKIs產(chǎn)生耐藥[29-31]；②有報道[32]腫瘤細胞微環(huán)境改變與獲得性耐藥有關(guān)，可能與TGF-β及IL-6的分泌有關(guān)；③EGFR-TKIs可誘導(dǎo)FGFR2和FGFR3信號通路，從而引發(fā)對其產(chǎn)生快速的獲得性耐藥[33]，聯(lián)合應(yīng)用EGFR和FGER酪氨酸酶抑制劑，可逆轉(zhuǎn)TKIs耐藥；④近來有研究報道[34]，EGFR野生型患者中BCRP/ABCG2高表達可對吉非替尼產(chǎn)生獲得性耐藥。細胞信號傳導(dǎo)過程復(fù)雜，具有多向性，因此對EGFR-TKIs耐藥機制的研究仍是當前靶向治療領(lǐng)域的探索熱點。

4 展望

EGFR-TKIs雖然在晚期NSCLC治療中發(fā)揮了重要作用，但其原發(fā)與獲得性耐藥問題已經(jīng)成為限制其療效進一步提高的瓶頸，因此對其耐藥機制的深入研究，尋找克服耐藥的治療方法，已經(jīng)成為腫瘤研究領(lǐng)域的迫切任務(wù)。隨著基礎(chǔ)研究和臨床實驗的不斷深入，EGFR-TKIs藥物耐藥機制逐漸清晰，越來越多的針對腫瘤耐藥機制或作用于其它相關(guān)信號通路的靶向藥物逐漸進入臨床，并取得一定療效。

目前針對EGFR-TKIs耐藥問題，臨床治療策略主要涉及以下方面：①研究發(fā)現(xiàn)不可逆的EGFR-TKIs可用于對抗有EGFR突變的NSCLC患者的吉非替尼和厄洛替尼的耐藥性。與可逆性TKIs不同的是，不可逆的EGFR-TKIs與EGFR TK區(qū)永久性結(jié)合；②“旁路激活途徑”在EGFRTKIs耐藥中發(fā)揮重要作用，腫瘤細胞信號傳導(dǎo)相互交錯，單靶點藥物不能阻斷腫瘤細胞所有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此開發(fā)多靶點的靶向治療藥物成為新的研究趨勢[35]；③某些生物學(xué)分子標記物與EGFR-TKIs療效相關(guān)。為使EGFRTKIs的臨床應(yīng)用更為合理有效，需確定有效的預(yù)測靶標及最佳的檢測方法，選擇適合的患者接受TKIs治療，進一步提高NSCLC的療效和生存，最大限度地避免無效的治療。隨著對EGFR-TKIs原發(fā)性和獲得性耐藥機制的不斷深入探討，與EGFR-TKIs療效有關(guān)的分子生物標記及其之間的相互關(guān)系必將越來越明了，有望使個體化治療更上一個臺階。