邱小明 喬艷潔 劉斌 李洋 尤嘉琮 綜述 周清華 審校

肺癌是當今世界上對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤，也是臨床治療療效最差的惡性腫瘤。據(jù)估計2008年全世界有160萬人被診斷為肺癌，占所有腫瘤的13%，約140萬人死于肺癌，占所有腫瘤死亡的18%[1]。2010年在美國約有16萬人死于肺癌，在男性和女性均位列首位。其中，男性因肺癌死亡8.6萬人，占所有腫瘤死亡的29%，超過了位列第2-4位的前列腺癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌死亡人數(shù)的總和；女性肺癌死亡7.1萬人，占所有腫瘤死亡的26%，超過了位于第2、3位的乳腺癌和結(jié)直腸癌死亡人數(shù)的總和[2]。肺癌總的5年生存率僅為16%，遠遠低于男性發(fā)病首位的前列腺癌（100%）和女性發(fā)病首位的乳腺癌（90%）。肺癌如果在局限期得到發(fā)現(xiàn)，則其5年生存率能提高到53%，然而目前僅有15%的患者能在早期發(fā)現(xiàn)。

與前列腺癌和乳腺癌相比，肺癌目前缺乏理想的早期篩查手段。胸片和痰細胞學檢測已用于肺癌的篩查，具有經(jīng)濟和方便的優(yōu)勢，但其敏感性和特異性不高，而且在高危人群進行篩查并不能降低肺癌的死亡率[3,4]。低劑量螺旋CT有很高的敏感性，能發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)數(shù)毫米的微小病變，新篩查出的肺癌病例80%以上為I期[5-7]，如果立即手術(shù)其10年生存率達92%，而所有未治療的I期患者均在5年內(nèi)死亡[8]。然而應(yīng)用低劑量螺旋CT進行肺癌篩查也存在一些問題：首先作為大規(guī)模篩查手段其費用較高；其次敏感性很高，能檢查出大量非鈣化結(jié)節(jié)，其中非腫瘤性結(jié)節(jié)遠遠高于腫瘤性結(jié)節(jié)，特異性不高。有研究[9]顯示低劑量螺旋CT發(fā)現(xiàn)的非鈣化結(jié)節(jié)中實際為腫瘤的結(jié)節(jié)不到2%，而確定這些結(jié)節(jié)的良惡性需要定期的CT隨訪檢查、活檢或者手術(shù)，對大部分良性結(jié)節(jié)患者這將造成巨大的精神負擔、經(jīng)濟負擔甚至身體創(chuàng)傷。

由于影像學技術(shù)在肺癌早期篩查中未能顯示出良好的效果，人們開始將目光轉(zhuǎn)向肺癌早期診斷的分子標志物，遺憾的是迄今為止沒有發(fā)現(xiàn)一個敏感性和特異性較高的分子標志物。近年來肺癌表觀遺傳學研究進展特別是DNA甲基化的研究[10]發(fā)現(xiàn)，肺癌發(fā)生早期就存在很多特有的腫瘤相關(guān)基因（其中包括癌基因和腫瘤抑制基因）甲基化程度的改變，為肺癌的早期診斷標志物的探索提供了新的契機。

1 DNA甲基化的原理及應(yīng)用

DNA甲基化是指在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA中CG兩個核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基基團的化學修飾現(xiàn)象[11]。DNA甲基化通常發(fā)生在基因的5'端啟動子和第1外顯子“CpG島”區(qū)域，長約1 kb，能夠引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄和表達[12,13]。近來研究[14]發(fā)現(xiàn)DNA甲基化還發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄起始點上游2 kb左右稱為“CpG島岸”（CpG island shore）的區(qū)域，絕大部分組織特異性的DNA甲基化發(fā)生在“CpG島岸”而非“CpG島”區(qū)域，在結(jié)腸癌中大部分腫瘤特異的DNA甲基化差異區(qū)域分布在“CpG島岸”。由于DNA甲基化出現(xiàn)在幾乎所有腫瘤中，并且發(fā)生在癌前病變和癌變早期，因此是腫瘤早期診斷的理想標志物[15,16]。DNA甲基化檢測的優(yōu)勢在于，通過PCR擴增可以檢測很微量的組織DNA，具有很高的敏感性，并且DNA發(fā)生甲基化的區(qū)域明確，便于設(shè)計引物或探針檢測。某些基因的甲基化還可以在體液中檢測到，因此非常適合無創(chuàng)檢測應(yīng)用于腫瘤的早期診斷[17,18]。然而近年來通過高通量的芯片檢測發(fā)現(xiàn)每個基因都有一個以上的甲基化位點，任何一個位點的甲基化都沒有出現(xiàn)在所有腫瘤中，某一位點的檢測只能診斷出一個亞類的腫瘤，而且不同人的甲基化模式也不相同，因此對于基因的表達和腫瘤的發(fā)生起到關(guān)鍵作用的甲基化位點和模式還需要進一步的研究[14,19-21]。近年來已有大量DNA甲基化的研究[20-22]，特別是腫瘤中單個或多個基因的甲基化的檢測，結(jié)合分析其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用以及與臨床病理特征的關(guān)系，可以用于疾病的早期篩查、預(yù)防、診斷治療與預(yù)后分析。

2 DNA甲基化在肺癌早期診斷中的應(yīng)用

DNA甲基化改變常發(fā)生于腫瘤形成過程，包括全基因組水平DNA低甲基化和CpG島高甲基化[23]。腫瘤組織中全基因組水平DNA低甲基化可以激活原來保持沉默的原癌基因表達，而高甲基化使DNA轉(zhuǎn)錄受到抑制，使經(jīng)典抑癌基因、細胞周期調(diào)控基因和DNA錯配修復(fù)基因不表達或低表達從而引發(fā)腫瘤[24-27]。因此檢測這些基因是否有高甲基化將有望在肺癌發(fā)生的早期發(fā)現(xiàn)腫瘤。對于DNA甲基化在肺癌早期診斷中的應(yīng)用探索，也經(jīng)歷了從單基因檢測到多基因聯(lián)合檢測、從肺癌組織中檢測到各種無創(chuàng)微創(chuàng)介質(zhì)檢測的發(fā)展過程。

2.1 肺癌組織DNA甲基化的檢測 DNA甲基化標志物要作為早期診斷的指標，首先必須證實其與肺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，在肺癌組織中有高甲基化，并且最好能在早期肺癌甚至原位癌或者癌前病變中就能檢測到。而腫瘤的發(fā)生是多步驟、多因素并涉及很多基因改變的復(fù)雜過程，其中抑癌基因的失活是腫瘤發(fā)生的重要分子基礎(chǔ)，早期的研究集中驗證了各個已知的抑癌基因在肺癌組織中的甲基化和基因表達情況，并分析其與腫瘤類型、分期等的關(guān)系，以期作為早期篩查的標志物。

抑癌基因p16是重要的細胞周期調(diào)控基因，能負責調(diào)節(jié)細胞的增殖及分裂，一旦失活則會導致細胞惡性增殖發(fā)生惡性腫瘤。Belinsky等[28]用甲基化特異性PCR（methylation specific PCR, MSP）的方法檢測了18例肺鱗癌患者，發(fā)現(xiàn)11例（61.1%）患者的p16啟動子發(fā)生了較高水平的甲基化，并且在其中75%的癌旁原位癌組織中檢測到p16啟動子甲基化，甚至在很早期癌前病變基底細胞增生（17%）和鱗狀上皮化生（24%）中就發(fā)現(xiàn)p16啟動子甲基化，因此被認為可作為肺癌早期診斷的標志物。而另外的報道有不同的結(jié)果，Kim等[29]檢測了185例肺癌組織，其中僅50例（27%）發(fā)現(xiàn)p16啟動子甲基化，其中鱗癌（41%）的甲基化陽性率高于腺癌（22%）。不同文獻[30-42]報道的p16甲基化的陽性率差異較大（21.9%-80.2%），其差異可能是由于檢測的方法、選擇的人群、肺癌的病理類型及檢測樣本量的不同引起。

抑癌基因APC通過調(diào)節(jié)微管的穩(wěn)定性，影響細胞遷移能力，起到維持染色體穩(wěn)定性的作用，其失活與結(jié)腸癌等多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。Brabender等[43]報道，在91例非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者的腫瘤組織中，86例（95%）檢測到APC啟動子區(qū)甲基化陽性，而且這些患者的正常肺組織中也檢測到80例（88%）陽性，而在10例正常對照組人群肺組織標本中僅2例（20%）陽性，差異明顯，有望成為診斷標志物。Usadel等[44]也報道了在99例原發(fā)性肺癌組織中發(fā)現(xiàn)95例（96%）有APC啟動子甲基化。而大部分其它研究報道的陽性率則不高，Kim等[45]檢測了99例外科切除肺癌組織，其中僅48例（48%）發(fā)現(xiàn)APC啟動子甲基化。而Lin等[46]檢測了123例I期NSCLC，其中僅49例（40%）檢測到APC啟動子區(qū)域甲基化。Virmani等[47]用MSP的方法檢測發(fā)現(xiàn)106例NSCLC組織和細胞系中56例（53%）甲基化，50例小細胞肺癌中13例（26 %）甲基化，而68例非癌組織中3例（4%）甲基化。Zhang等[48]檢測了78對NSCLC組織和配對的癌旁組織中APC基因甲基化的情況，其中肺癌中甲基化率為56%（44例），而癌旁組織中僅為13%（10例），盡管陽性率不高，但是在正常組織和癌組織中差異明顯，仍有可能成為早期診斷的標志物。

RASSF1A作為一個腫瘤抑制基因，能夠通過穩(wěn)定微管、調(diào)控細胞周期和誘導凋亡而發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生的作用[49]。Dammann等[50]從3號染色體短臂上克隆并證實RASSF1A基因在肺癌中表達缺失，并且主要與啟動子區(qū)域高甲基化有關(guān)。Endoh等[51]檢測了100例NSCLC組織，發(fā)現(xiàn)其中42例（42%）有RASSF1A甲基化，但其結(jié)果提示RASSF1A甲基化與腫瘤的類型、分期等沒有相關(guān)性。但Tomizawa等[52]檢測110例I期肺腺癌發(fā)現(xiàn)35例（32%）有RASSF1A甲基化，并且與胸膜、血管侵犯和分化差相關(guān)。Zhang等[48]檢測78例NSCLC組織和配對的癌旁組織中RASSF1A基因甲基化的情況，其中肺癌中甲基化率為39.7%（31例），而癌旁組織中僅為7.7%（6例）。其它報道[53-57]的肺癌中RASSF1A基因甲基化率在29%-41%。

其它研究較多的抑癌基因和腫瘤相關(guān)基因包括DAPK、FHIT、DLEC1、RARβ、hMLH1、MGMT、CDH1、CDH13、CADM1、CALCA等[58]，經(jīng)過這些研究大量基因被證實在肺癌組織中存在不同程度的甲基化，其差異可能源于采取的檢測方式、檢測的人群以及病理類型的不同，但總的來說單個基因甲基化的陽性率不高，無法達到肺癌早期篩查的標準。而且大多數(shù)研究僅僅檢測腫瘤組織的甲基化情況，缺乏對照，無法評價其作為診斷指標的敏感性和特異性。因此進一步的研究還需要探索和發(fā)現(xiàn)敏感性和特異性更高的DNA甲基化標志物，或者聯(lián)合檢測多個DNA甲基化標志物，以提高其作為早期診斷指標的敏感性和特異性。

隨著研究的深入和技術(shù)的進步，近年來DNA甲基化的研究則側(cè)重于運用高通量檢測技術(shù)以驗證和評價多個已知的甲基化位點作為肺癌早期診斷的價值，并探索和發(fā)現(xiàn)新的肺癌甲基化標志物。甲基化熒光定量PCR（MethyLight）是一種熒光實時定量甲基化特異性PCR技術(shù)，通過引物和探針設(shè)計，可以同時檢測多個目的基因的甲基化情況。Feng等[59]應(yīng)用MehtyLight技術(shù)檢測了49對NSCLC組織和癌旁組織的27個基因甲基化情況，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測RASSF1、DAPK1、BVES、CDH13、MGMT、KCNH5、RARβ和CDH1的甲基化情況在肺癌組織中陽性率為80%，而在癌旁組織中僅為14%。Jin等[60]檢測了72例肺癌患者腫瘤和癌旁組織的p16、APC、CDH13、RARβ、RASSF1、RUNX3和MYOD1 7個基因甲基化情況，發(fā)現(xiàn)鱗癌和腺癌的甲基化模式有差異。Tsou等[61]應(yīng)用MehtyLight技術(shù)檢測了51例肺腺癌，38例肺癌患者的遠癌肺組織和11例非肺癌患者的肺組織的28個甲基化位點，其中CDH13、CDKN2A EX2、CDX2、HOXA1、OPCML、RASSF1、SFPR1和TWIST1在腺癌中高甲基化，而聯(lián)合CDKN2A EX2、CDX2、HOXA1和OPCML用于檢測肺腺癌和癌旁組織的敏感性達到94%，特異性達到90%。Anglim等[62]應(yīng)用MehtyLight技術(shù)檢測了45對鱗癌和癌旁組織的42個甲基化位點，發(fā)現(xiàn)鱗癌中GDNF、MTHFR、OPCML、TNFRSF25、TCF21、PAX8、PTPRN2和PITX2這8個基因甲基化程度明顯高于癌旁組織，聯(lián)合這8個基因的甲基化對于檢測鱗癌達到95.6%的敏感性和特異性。甲基化發(fā)生在腫瘤發(fā)生的非常早期，Selamat等[63]分析了249例組織樣本的15個甲基化位點，包括正常的癌旁組織、非典型腺瘤樣增生（atypical adcnomatous hyperplasia, AAH）組織、原位腺癌（adenocarcinoma insitu, AIS）和侵襲性腺癌組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDKN2A EX2和PTPRN2的甲基化程度在AAH時已經(jīng)明顯升高，而2C35、EYA4、HOXA1、HOXA11、NEUROD1、NEUROD2和TMEFF2的甲基化程度在AIS時明顯升高，而CDH13、CDX2、OPCML、RASSF1、SFRP1及TWIST1的高甲基化和全基因組低甲基化主要出現(xiàn)在侵襲性腺癌中，這些結(jié)果將有助于癌前病變和早期肺癌的診斷。

Ehrich等[64]利用以質(zhì)譜分析為基礎(chǔ)的胞嘧啶甲基化譜分析（cytosine methylation profiles）技術(shù)分析了96例患者肺癌和癌旁組織的47個甲基化位點，發(fā)現(xiàn)CLEC3B、MGP、RASSF1、SDK2、SERPINB5和XAGE1A這6個基因的甲基化在肺癌組織中明顯高于相應(yīng)癌旁正常肺組織。限制性標記基因組掃描（restriction landmark genomic scanning）通過二維電泳在一塊膠上最多可以分析2,000個啟動子序列，運用該技術(shù)Dai等[65]對1,184個CpG島的研究發(fā)現(xiàn)11個基因和6個ESTs在肺癌和正常組織中甲基化有差異，其中GNAL和PDX1基因的甲基化比例超過50%。

芯片技術(shù)的發(fā)展為DNA甲基化研究提供了更好的平臺，具有高通量、大規(guī)模、高靈敏性等特點。甲基化芯片能將所有已知的甲基化位點集成在一張芯片上，同時檢測整個腫瘤甲基化的變化，從而更深入地理解肺癌發(fā)生發(fā)展中DNA甲基化的模式，篩選出在肺癌中有診斷價值的新的DNA甲基化標志物[66,67]。Field等[68]運用甲基化芯片技術(shù)設(shè)計檢測59個候選基因的245個甲基化位點，發(fā)現(xiàn)鱗癌中ADPRH、GP1BB、RARβ和TMEFF2高甲基化，腺癌中CDKN1C、MGMT和TMEFF2高甲基化。Fukasawa等[69]運用類似方法研究分析288個腫瘤相關(guān)基因的啟動子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)28個潛在的甲基化標志物，進一步研究發(fā)現(xiàn)PAX3和ASC在肺癌組織中有很高的甲基化率。Rauch等[70,71]使用含有12,192個CpG島的甲基化芯片，發(fā)現(xiàn)包括肺癌中包括DLEC1和PAX7等基因在內(nèi)的50個甲基化位點有明顯差異，進一步研究發(fā)現(xiàn)HOXA9和HOXA7等基因可作為鱗癌診斷的標志物。Bibikova等[72]應(yīng)用基于磁珠的液相甲基化芯片技術(shù)在腺癌中對807個基因的1,505個CpG位點進行分析，發(fā)現(xiàn)一組特異性的甲基化譜包括ASCL2、CDH13、HOXA11、HOXA5、NPY、RUNX3、TERT和TP73。目前最新的甲基化芯片包括了近3萬個甲基化位點，能覆蓋了整個基因組范圍95%以上的甲基化位點。

基因表達譜芯片技術(shù)也被用于探索潛在的甲基化位點，通過基因表達譜芯片對比甲基化抑制劑5-Aza-dC處理前后基因表達譜的變化，可以篩選出大量甲基化基因。Shames等[73]通過這種方法發(fā)現(xiàn)132個腫瘤特異性的甲基化位點，其中7個（ALDH1A3、BNC1、CCNA1、CTSZ、LOX、MSX1和NRCAM）在肺癌和癌旁組織中差異明顯，可作為肺癌診斷標志物。

通過這些高通量的檢測方法可以迅速地篩選出很多潛在的甲基化標記物，但是這些新的標記物必須通過傳統(tǒng)方法在原發(fā)腫瘤組織中進行驗證。目前不同文獻報道的甲基化位點各不相同，很多基因并沒有重復(fù)性，因此還需要更多的試驗進行探索和驗證，并盡可能地排除人種、腫瘤病理類型和數(shù)據(jù)分析方法等因素的影響。

DNA甲基化作為肺癌早期診斷的分子標志物，其敏感性和特異性是研究關(guān)注的焦點。在以往的研究中DNA甲基化對肺癌診斷的敏感性和特異性也存在很大的差異，目前尚未發(fā)現(xiàn)敏感性和特異性非常高的DNA甲基化標志物。在不斷探索和篩選敏感性和特異性更高的DNA甲基化標志物的同時，人們也在不斷優(yōu)化組合現(xiàn)有的DNA甲基化標志物，通過多基因聯(lián)合檢測以提高早期診斷的敏感性和特異性。Shivapurkar等[74]報道了HS3ST2、DAPK和TNFRSF10C組合區(qū)分肺癌和癌旁組織的受試者工作特征曲線的曲線下面積達到0.959，用于診斷肺癌有很高的敏感性和特異性。Ehrich等[64]報道的6個基因的組合分辨肺癌和癌旁組織的敏感性和特異性均大于95%。而Bibikova等[72]報道的55個基因的組合區(qū)分腺癌和癌旁組織的敏感性達到100%，特異性達到92%。Tsou等[61]報道了5個基因的組合診斷肺腺癌的敏感性達94%，特異性達90%。Anglim等[62]報道了8個基因組合檢測鱗癌達到95.6%的敏感性和特異性。Zhang等[48]報道了5個基因的組合用于診斷肺癌的敏感性達到83.64%，特異性達74.0%。盡管這些報道非常鼓舞人心，但是這些結(jié)果還需要更大量的人群進行驗證。同時，肺癌組織的檢測并不能用于肺癌的早期篩查中，因此這些標志物還需要在早期篩查中常用的無創(chuàng)微創(chuàng)介質(zhì)如血液、痰液中進行驗證，以評價其敏感性和特異性。

2.2 血液中DNA甲基化的檢測 外周血是肺癌早期篩查和診斷比較理想的樣本，腫瘤患者血液中存在腫瘤細胞釋放的高水平的循環(huán)DNA，并且與原發(fā)腫瘤有著相同的基因改變[75,76]。Usadel等[44]在47%的肺癌患者血清中發(fā)現(xiàn)APC基因甲基化。Ulivi等[40]報道肺癌患者血清中p16和CDH13的甲基化陽性率分別為26%和23%。Liu等[41]報道肺癌患者血清中p16甲基化為72%，Bearzatto等[77]報道肺癌患者血清中p16甲基化為55%。Wang等[78]也報道肺癌患者血清中RASSF1A甲基化為33.8%（27/80），而在良性肺疾病患者和正常人血清中沒有檢測到。Kneip等[79]報道了SHOX2甲基化診斷肺癌的敏感性為60%，特異性達到90%，且分期越晚，敏感性越高。

同樣也有大量研究聯(lián)合檢測多個甲基化標志物，以提高診斷的敏感性和特異性。Esteller等[76]檢測了22例肺癌患者的腫瘤組織和血清中DNA的p16、DAPK、GSTP1和MGMT的甲基化情況，結(jié)果顯示15例（68%）的患者至少有1個基因甲基化，而在這些患者血液中11例（72%）患者發(fā)現(xiàn)基因甲基化。Fujiwara等[80]檢測了91例肺癌患者，發(fā)現(xiàn)血清中MGMT甲基化為18.7%，p16為15.4%，RASSF1A為12.1%，DAPK為11.0%，RARβ為6.6%；以這5個基因作為診斷指標檢測肺癌的敏感性為49.5%，特異性為85.0%。其中1個基因甲基化陽性患肺癌的相對危險度為5.28。Tan等[81]檢測了肺癌患者血漿中RUNX3甲基化為55%（11/20），p16為50%（10/20），RASSF1A為30%（6/20），CDH1為20%（4/20），以這4個基因為標志物檢測肺癌陽性率為90%（19/20）。Hsu等[82]篩選6個基因組合（BLU、CDH13、FHIT、p16、RARβ和RASSF1A），其腫瘤和血漿樣本甲基化的一致率分別為86%、87%、80%、75%、76%和84%，以其中血漿中檢測到兩個基因甲基化為診斷標準篩查肺癌的敏感性為73%，特異性為82%。Ostrow等[83]選擇4個基因組合（DCC、Kif1a、NISCH和Rarβ）檢測肺癌的敏感性為73%，特異性為71%，結(jié)合CT能更好的診斷肺癌。Begum等[84]篩選了6個基因組合（APC、CDH1、MGMT、DCC、RASSF1A和AIM），其中DCC 1個基因的檢測敏感性為35.5%，特異性為100%，而6個基因的組合檢測敏感性增加到75%，而特異性下降到73%。

然而血液中DNA甲基化檢測的最大不足之處是缺乏組織特異性，目前檢測的這些甲基化的基因標志物不僅在肺癌中有甲基化，在很多其它腫瘤中也有甲基化，尚未發(fā)現(xiàn)1個標志物只在肺癌中有甲基化。因此血液中的甲基化檢測異常的結(jié)果還需要結(jié)合特異性更高的影像學檢查，以確定腫瘤的位置。目前隨著甲基化芯片、焦磷酸測序等技術(shù)用于肺癌基因甲基化的研究中，期望能發(fā)現(xiàn)肺癌特異性的甲基化標志物。另外，在肺來源的檢測介質(zhì)中檢測DNA甲基化有望增加檢測的特異性。

2.3 痰液中DNA甲基化的檢測 痰液含有來自肺和下呼吸道的脫落細胞，具有一定的特異性，痰液中的甲基化檢測也有較多報道。Belinsky等[28]最早在痰液中檢測了p16甲基化，在7例肺癌患者中發(fā)現(xiàn)3例有p16甲基化，而26例對照僅有5例發(fā)現(xiàn)p16甲基化，有明顯差異。隨著檢測技術(shù)的改進和敏感性的提高，Palmisano等[85]報道肺癌發(fā)生前3年在所有鱗癌患者的痰液中就能檢測出p16和/或MGMT的甲基化。Liu等[41]檢測了50例肺癌患者，其中痰液中p16甲基化率為76%，并發(fā)現(xiàn)只有腫瘤組織有p16甲基化的肺癌患者痰液中檢測到p16甲基化。Wang等[86]報道肺癌中hMLH1啟動子區(qū)甲基化陽性率為55.8%，而在痰液中檢測的一致率為72%。Olaussen等[87]檢測發(fā)現(xiàn)了95.5%的肺癌患者痰液中細胞學檢測陰性，而DNA甲基化檢測卻有陽性發(fā)現(xiàn)。Belinsky等[88]檢測了肺癌患者和吸煙者痰液中的p16、MGMT、RASSF1A和DAPK等7個基因，發(fā)現(xiàn)＞3個基因甲基化陽性肺癌患者是吸煙者的6.2倍。進一步設(shè)計病例對照研究[89]發(fā)現(xiàn)，基因甲基化隨著診斷肺癌的時間接近而增加，以p16、MGMT、DAPK、RASSF1A、PAX5b和GATA5這6個基因作為評價指標，其中≥3個基因甲基化陽性肺癌風險增加6.5倍，篩查肺癌的敏感性和特異性達到65%。其它在痰液中評價的基因還有ASC/TMS1[90]和HOXA9[91]。但是痰液作為檢測介質(zhì)的局限主要來自中央大氣道，因此對于鱗癌的診斷價值比較大，而對于主要在肺周圍的腺癌則可能不太適合。

2.4 支氣管灌洗液中DNA甲基化的檢測 同痰液類似，支氣管灌洗液（bronchoalveolar lavage, BAL）來源于肺的特定肺葉，可能含有肺癌細胞或者DNA可用于肺癌早期診斷。雖然獲取支氣管灌洗液無創(chuàng)，但需要借助氣管鏡，對于患者來說還是一項比較痛苦的操作，因此限制了其在大規(guī)模篩查中的應(yīng)用。但是對于懷疑肺癌的高?；颊撸瑲夤茜R是必做的檢查，因此對于這部分人群BAL還是容易獲得和理想的檢查介質(zhì)。Ahrendt等[92]最早檢測了BAL中的p16甲基化，發(fā)現(xiàn)50例患者的肺癌組織中有19例發(fā)現(xiàn)p16甲基化，這19例患者中11例在BAL中檢測到p16甲基化。Grote等[93,94]報道在支氣管灌洗液中APC甲基化診斷肺癌的敏感性達98.5%，而特異性為39%，聯(lián)合p16和RARβ2診斷肺癌敏感性69%，特異性達87%。Kim等[95]檢測了85例NSCLC患者的BAL發(fā)現(xiàn)68%的樣本至少檢出p16、RARβ、H-cadherin和RASSF1A其中之一的甲基化。Topaloglu等[96]報道了聯(lián)合檢測APC、MGMT、RASSF1A、p16等8個基因，在肺癌患者BAL中的陽性率為68%。Schmiemann等[97]的一項回顧性病例對照研究中報道247例可疑肺癌患者（確診89例）的BAL中，聯(lián)合APC、p16和RASSF1A甲基化檢測的診斷敏感性為53%，特異性為99%。

2.5 呼出氣冷凝液中DNA甲基化的檢測 呼出氣檢測是近年來處于探索階段的比較新的無創(chuàng)檢測方式，在診斷哮喘、慢性阻塞性肺病等肺疾病中已初步體現(xiàn)出應(yīng)用價值。呼出氣冷凝液（exhaled breath condensate, EBC）中除了大部分水蒸氣外，還含有脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等，可用于肺癌的診斷[98]。而目前在EBC中檢測DNA甲基化的報道較少，Han等[99]檢測17例肺癌患者和37例健康對照的EBC中DAPK、RASSF1A和PAX5β啟動子區(qū)甲基化情況，初步證實了EBC中DNA來源于肺，檢測其基因甲基化模式可以區(qū)分出肺癌患者和吸煙對照人群。呼出氣冷凝液中DNA甲基化檢測在肺癌診斷中的價值尚需要更多研究探索。

3 問題與展望

盡管近年來DNA甲基化用于早期肺癌診斷受到廣泛的關(guān)注，對大量的DNA甲基化標志物應(yīng)用于肺癌診斷的價值也進行了探索和驗證，但是目前DNA甲基化分子標志物應(yīng)用于臨床肺癌診斷還存在著一些問題。首先由于采取的檢測方式、檢測的人群以及病理類型的不同，各個基因在不同報道中的甲基化陽性率有較大差異；其次作為腫瘤標記物，單個基因的陽性率不高，特異性很高的位點極少，達不到用于肺癌早期篩查的標準；另外，用于臨床診斷和篩查的標本應(yīng)該是無創(chuàng)或微創(chuàng)方式得到的介質(zhì)，如痰液、血液等，而大量的DNA甲基化標志物尚未在這些標本中進行驗證。隨著研究的不斷深入和各種高通量研究手段的應(yīng)用，更多敏感性和特異性高的DNA甲基化標志物有望被發(fā)現(xiàn)并用于肺癌早期診斷試劑盒的開發(fā)，成為肺癌早期診斷的有力工具。