李曉燕 高天慧 周云 王文玉 李林蔚

食管癌是一種嚴(yán)重危害我們?nèi)祟惤】档钠鹪从谙朗彻莛つど掀さ膼盒阅[瘤，而且食管癌的發(fā)病率和死亡率在世界上均排名惡性腫瘤的前列［1，2］。更為重要的是，中國(guó)歷年來(lái)是食管癌的高發(fā)地區(qū)，其中最主要的病理類型為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)［3，4］。

人食管癌相關(guān)基因4(esophageal cancer related gene 4，ECRG4)是重要的食管癌相關(guān)的新基因［5，6］。我們發(fā)現(xiàn)，人食管癌相關(guān)基因4的基因表達(dá)的下降在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生中具有非常重要的地位。目前，人食管癌相關(guān)基因4蛋白的生物學(xué)抑制腫瘤生長(zhǎng)的功能還不清楚。我們的初期研究結(jié)果表明，人食管癌相關(guān)基因4是食管癌的候選抑癌基因，人食管癌相關(guān)基因4蛋白是食管癌預(yù)后的標(biāo)志物。人食管癌相關(guān)基因4可以通過(guò)參與炎癥反應(yīng)的中心通路，并且下調(diào)炎癥產(chǎn)物環(huán)氧化酶-2的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的功能［7-9］。Mori等［10］研究進(jìn)一步證實(shí)了我們的結(jié)論。

以往的研究表明，人食管癌相關(guān)基因4是腫瘤相關(guān)抑癌基因，人食管癌相關(guān)基因4的表達(dá)過(guò)量能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖［7］。然而，關(guān)于人食管癌相關(guān)基因4蛋白的亞細(xì)胞定位和抗腫瘤增殖功能國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，我們檢測(cè)人食管癌相關(guān)基因4蛋白的亞細(xì)胞定位，同時(shí)進(jìn)一步研究純化的重組人食管癌相關(guān)基因4蛋白的體外抑癌功能，研究重組人食管癌相關(guān)基因4蛋白能否成為未來(lái)的食管癌的生物治療藥物。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 我們采用人的食管癌細(xì)胞系EC9706和NEC，和動(dòng)物的永生化細(xì)胞株HEK293。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)利用含有10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃和5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱。實(shí)驗(yàn)用的DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素等試劑都購(gòu)買于美國(guó)Gibco公司。醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所自己研制了抗人食管癌相關(guān)基因4蛋白的多克隆抗體［7］。羊抗兔 IgG購(gòu)自 Santa Cruz公司。Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 人食管癌相關(guān)基因4蛋白的亞細(xì)胞定位 1)內(nèi)源性:將EC9706腫瘤細(xì)胞接種到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中，等到腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)到符合條件，采用即時(shí)準(zhǔn)備的4%多聚甲醛固定腫瘤細(xì)胞10 min。PBS溶液沖洗三次。0.2%triton X-100細(xì)胞通透化處理10 min。PBS溶液沖洗三次。再利用即時(shí)準(zhǔn)備的2%BSA封閉30 min。PBS溶液沖洗三次。然后我們?cè)偌尤爰磿r(shí)稀釋的抗人食管癌相關(guān)基因4蛋白的多克隆抗體，在溫箱中放置1 h。PBS洗三遍，5 min/次。加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫孵育45 min。PBS溶液沖洗三次。然后我們?cè)偌尤爰磿r(shí)準(zhǔn)備的0.5 μg/ml的DAPI溶液染色15 min。PBS溶液沖洗三次。最后我們加入即時(shí)準(zhǔn)備的20 μl封片劑封片，冰箱中備用。熒光照相裝置利用激光共聚焦顯微鏡拍照定位。DAPI(藍(lán)色)染細(xì)胞核。2)外源性:我們利用NEC腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染標(biāo)記了綠色熒光蛋白的人食管癌相關(guān)基因4的基因質(zhì)粒，表達(dá)出了伴隨有綠色熒光蛋白的人食管癌相關(guān)基因4蛋白。具體步驟為將EC9706腫瘤細(xì)胞接種到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中，等到腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)到符合條件，參照LipofectminTM2000試劑盒的說(shuō)明分別轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-ECRG4及空載質(zhì)粒。2 d后扔掉腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS溶液沖洗三次，取出玻片，然后用4%的多聚甲醛固定腫瘤細(xì)胞30 min。PBS溶液沖洗三次，然后在玻片上加入一定的甘油緩沖液(將NaHCO33.7 g和Na2CO30.6 g溶于100 ml去離子水中，用NaOH調(diào)pH至9.5，加入等量的甘油，充分混合)，蓋在載玻片上，封片，防止氣泡產(chǎn)生。熒光照相裝置利用激光共聚焦顯微鏡拍照定位。

1.3 分泌蛋白的檢測(cè) 計(jì)數(shù)瞬轉(zhuǎn)后培養(yǎng)24 h的EC9706/pcDNA3.1和EC9706/pcDNA3.1-ECRG4細(xì)胞，然后我們?nèi)拥裟[瘤細(xì)胞培養(yǎng)基，然后腫瘤細(xì)胞離心15 min，然后我們用濾膜過(guò)濾腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，濾過(guò)液Heto FD3(Heto-Holten，Denmark)濃縮。

1.4 MTT腫瘤細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn) 將一定數(shù)量的EC9706腫瘤細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后利用PBS溶液沖洗腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)孔三次，然后我們用相應(yīng)的濃度的重組人食管癌相關(guān)基因4蛋白溶液處理腫瘤細(xì)胞，并設(shè)立對(duì)照實(shí)驗(yàn)組，腫瘤細(xì)胞再繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測(cè)時(shí)我們每孔加入即時(shí)配制的MTT溶液15 μl，然后腫瘤細(xì)胞再培養(yǎng)4 h，最后我們?nèi)拥裟[瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔中再加入DMSO溶液150 μl，混勻溶液，最后我們利用酶標(biāo)儀測(cè)定溶液吸光度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 11.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人食管癌相關(guān)基因4蛋白的定位 1)內(nèi)源性:利用免疫熒光染色的方法證實(shí)內(nèi)源性表達(dá)的人食管癌相關(guān)基因4蛋白的定位是位于細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)部位。2)外源性:利用綠色熒光蛋白標(biāo)記人食管癌相關(guān)基因4蛋白的方法證實(shí)，外源性表達(dá)的人食管癌相關(guān)基因4蛋白的定位也位于細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)部位。

2.2 人食管癌相關(guān)基因4蛋白是分泌性蛋白 利用Western blot的檢測(cè)方法證實(shí)，人食管癌相關(guān)基因4蛋白是分泌性蛋白。

2.3 重組人食管癌相關(guān)基因4蛋白體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖

利用MTT檢測(cè)的方法證實(shí)，重組人食管癌相關(guān)基因4蛋白能夠在細(xì)胞培養(yǎng)液中抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖(P＜0.05)。

3 討論

人食管癌相關(guān)基因4是與食管癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的重要的新基因，因此研究人食管癌相關(guān)基因4蛋白的生物學(xué)功能將具有重要的意義。研究結(jié)果表明內(nèi)源性和外源性人食管癌相關(guān)基因4蛋白都定位于細(xì)胞質(zhì)。而生物信息學(xué)分析提示，組成人食管癌相關(guān)基因4蛋白的148個(gè)氨基酸中，1-31個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，是重要的分泌性蛋白質(zhì)。本研究中，我們利用Western blot的檢測(cè)方法證實(shí)，人食管癌相關(guān)基因4蛋白的確是分泌性蛋白質(zhì)。而且，研究中我們進(jìn)一步通過(guò)優(yōu)化條件表達(dá)和純化出大量可溶性的重組人食管癌相關(guān)基因4蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們表達(dá)和純化的水溶性的重組人食管癌相關(guān)基因4蛋白具有體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖的生物學(xué)功能活性，為進(jìn)一步研究人食管癌相關(guān)基因4蛋白的晶體結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的抗腫瘤生物學(xué)功能創(chuàng)造了有利條件。

更重要的是，純化的水溶性重組人食管癌相關(guān)基因4蛋白可以作為食管癌的潛在治療藥物，值得進(jìn)一步深入的進(jìn)行體內(nèi)抗癌作用和抗癌作用機(jī)理研究。我們的結(jié)果首次證明了人食管癌相關(guān)基因4蛋白是分泌蛋白。目前，我們正在進(jìn)一步深入的研究人食管癌相關(guān)基因4蛋白的體內(nèi)外抑癌功能和作用機(jī)理，闡明其在食管癌發(fā)生中的作用。

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