杜衛(wèi)東，屠巍巍，孫 傳

浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院普外科（杭州 310006）

基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是一種依賴金屬鋅離子的金屬酶，是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)家族中的一員，屬于明膠酶，它可以選擇性地降解細胞外基質(zhì)。MMP-9 的活性可被組織金屬蛋白酶抑制因子-1（tissue inhibitor metalloproteins-1，TIMP-1）所抑制。MMP-9與TIMP-1的表達失去平衡在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵性的作用。人參皂苷Rg3 有多種抗腫瘤機制，本實驗旨在研究人參皂苷Rg3 可否通過改變HT-29 細胞MMP-9 mRNA 和TIMP-1 mRNA的表達，從而發(fā)揮抗腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的作用。

1 材料與方法

1.1 主要藥物 人參皂甙Rg3 純品購于大連富生天然藥物開發(fā)研究所，規(guī)格20 mg/瓶，純度為99.39%。

1.2 細胞株 HT-29細胞購于上海生命科學院。

1.3 試劑及儀器 RNA 提取試劑盒，MMP-1、β-actin引物均由上海生工提供。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas 公司。Taq DNA 聚合酶購于上海Promega 公司。DL2000bp DNA Marker 購于上海Promega 公司。ABI 公司PCR 儀，Bio-Rad 公司凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描條帶灰度，Quantity One v4.6.2軟件分析。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)及處理 HT-29 細胞在含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL 的DMEM 培養(yǎng)液，5%CO2，37 ℃及飽和濕度條件下培養(yǎng)。當細胞處于對數(shù)生長期時，棄去培養(yǎng)液，用PBS液洗滌細胞,加適量0.25%胰蛋白酶液消化細胞后，制成細胞懸液。人參皂苷Rg3 以DMSO 助溶，配成工作濃度2 μg/mL，以0.22 μm抽濾。以2×105個細胞的密度鋪于24孔板，分為4組：人參皂甙Rg3高劑量組（100 μg/mL）、中劑量組（50 μg/mL）、低劑量組（25 μg/mL）和空白對照組。對照組加10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液及同體積溶劑培養(yǎng)（DMSO 濃度＜0.1%）。培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后，收集細胞用Trizol 裂解，總RNA 提取按上海生工提供的RNA 提取試劑盒說明進行，用OD260/OD280鑒定RNA 純度，1%瓊脂電泳鑒定完整性。

1.4.2 RT-PCR 實驗 取2 μg 總RNA，按試劑盒說明進行RT-PCR。MMP-9 的引物序列為5'TCA GGGAGACGCCCATTT3'（上游）和5'TCAGCTCGG GTCGGGGCA3（下游），PCR 產(chǎn)物長408 bp；TIMP-1引物序列為5'AATCAACGACACCACTTA3'（上游）和5'TGAAACGAACGGACGGTG3'（下游），PCR 產(chǎn)物長419 bp；β-actin 引物序列為5’GATGCAGAAGGA GATCACTG3’（上 游）和5’TAGTCCGCCTAGAAG CATTTG 3’（下游），PCR 產(chǎn)物長207 bp。PCR 體系為：cDNA 4 μL，上下游引物各2 μL，dNTP(2 mM) 4 μL，10×PCR buffer 4 μL，Taq酶（2 U/μL）1 μL，反應總體系為40 μL。反應條件為：94 ℃變性2 min,94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，72 ℃終延伸10 min，30 循環(huán)。產(chǎn)物-20 ℃保存。PCR 產(chǎn)物于3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)，掃描其灰度并定值。MMP-9 條帶灰度/β-actin條帶灰度、TIMP-1條帶灰度/β-actin條帶灰度分別表示其相對表達量，實驗設平行孔，重復3次。

1.4.3 MTT法測定人參皂苷Rg3對HT-29結(jié)腸癌細胞的抑制率 每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去全部上清，每孔加入150 μLDMSO，微型振蕩器振蕩5～10 min使結(jié)晶完全溶解，在酶聯(lián)儀波長570 nm 處測出用藥后24、48、72 h 各孔吸光度值（A）。實驗共重復3次，按下列公式計算細胞生長抑制率：抑制率（IR）=（1-實驗組A/對照組A）×100%。

1.5 統(tǒng)計分析 實驗設平行孔，重復3次，結(jié)果用均數(shù)±標準差(±s)表示，統(tǒng)計采用SPSS 14.0軟件包，析因方差分析，多重比較。以P ＜0.05 為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg3 對MMP-9 mRNA 表達的影響

PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖電泳可看到與目的片段大小一致的電泳條帶。β-actin 片段為207 bp，MMP-9片段為408 bp（圖1）。

圖1 各劑量人參皂苷Rg3及對照培養(yǎng)HT-29細胞24 h后MMP-9 mRNA表達

經(jīng)不同濃度Rg3 處理后，不同時間點MMP-9 mRNA表達見表1。

表1 不同時間組各濃度Rg3處理后MMP-9 mRNA相對表達量（μg/mL，±s）

表1 不同時間組各濃度Rg3處理后MMP-9 mRNA相對表達量（μg/mL，±s）

注：與0 μg/mL組比較，aP＜0.05；與0 μg/mL組比較，aaP＜0.01

0 25 50 100 n3333 24 h 0.271±0.004 0.273±0.002 0.280±0.004 0.242±0.004aa 48 h 0.311±0.002 0.294±0.002a 0.276±0.002aa 0.236±0.002aa 72 h 0.343±0.005 0.300±0.005aa 0.257±0.002aa 0.218±0.002aa

實驗結(jié)果顯示，24 h 組：高劑量組與對照組相比，有顯著的統(tǒng)計學差異（P ＜0.01）；48 h 組：對照組與低、中、高劑量組相比均有顯著的統(tǒng)計學差異（P ＜0.05、P ＜0.01、P ＜0.01）；72 h 組：對照組與低、中、高劑量組相比均有顯著的統(tǒng)計學差異（P ＜0.01）。低劑量組：24 h組與48 h、72 h組相比，隨時間延長,MMP-9 mRNA 表達增高，有顯著的統(tǒng)計學差異（P ＜0.01）；48 h組與72 h組相比，無統(tǒng)計學差異（P ＞0.05）；中、高劑量組：24 h組與48 h組相比，無統(tǒng)計學差異（P ＞0.05），24 h組、48 h組與72 h組相比，有顯著的統(tǒng)計學差異（P ＜0.01）。提示中高濃度人參皂苷Rg3 可以抑制HT-29 細胞MMP-9 mRNA 的表達，抑制作用隨著劑量的增加及時間的延長而增強。

2.2 人參皂苷Rg3 對TIMP-1 mRNA 表達的影響

PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖電泳可看到與目的片段大小一致的電泳條帶。β-actin內(nèi)參照擴增片段為207 bp，TIMP-1 擴增片段為419 bp（圖2）。

圖2 各劑量人參皂苷Rg3及對照培養(yǎng)HT-29細胞24 h后TIMP-1 mRNA表達

經(jīng)不同濃度Rg3 處理后，不同時間點TIMP-1 mRNA表達見表2。

表2 不同時間組各濃度Rg3處理后TIMP-1 mRNA相對表達量（μg/mL，±s）

表2 不同時間組各濃度Rg3處理后TIMP-1 mRNA相對表達量（μg/mL，±s）

注：與0 μg/mL 組比較，aP＜0.01

0 25 50 100 3 3 3 3 24 h 0.141±0.003 0.148±0.002 0.180±0.002a 0.181±0.007a 48 h 0.138±0.002 0.155±0.001a 0.194±0.002a 0.210±0.005a 72 h 0.128±0.005 0.163±0.001a 0.212±0.005a 0.243±0.003a

實驗結(jié)果顯示，24 h 組：對照組與低劑量組相比，無統(tǒng)計學差異（P ＞0.05），與中、高劑量組相比，有顯著的統(tǒng)計學差異（P ＜0.01）；48 h組和72 h組：對照組與低、中、高劑量組相比均有顯著的統(tǒng)計學差異（P ＜0.01）。低劑量組：24 h組與48 h組相比，無統(tǒng)計學差異（P ＞0.05），24 h組與72 h組相比，有顯著的統(tǒng)計學差異（P ＜0.01）；48 h組與72 h組相比，有明顯的統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；中、高劑量組：24 h組與48 h 組、72 h 組相比，有顯著的統(tǒng)計學差異（P ＜0.01），48 h組與72 h組相比，有顯著的統(tǒng)計學差異（P ＜0.01）。提示人參皂苷Rg3 可以促進HT-29細胞TIMP-1 mRNA的表達，促進作用隨著劑量的增加及時間的延長而增強。

2.3 人參皂苷Rg3 對結(jié)腸癌細胞增殖的抑制率的影響 24 h組：低劑量組與中劑量組相比，無統(tǒng)計學差異（P ＞0.05），低、中劑量組與高劑量組相比，有顯著的統(tǒng)計學差異（P ＜0.01）；48 h組，低劑量組與中、高劑量組相比，有顯著的統(tǒng)計學差異（P ＜0.01），中劑量組與高劑量組相比，無統(tǒng)計學差異（P ＞0.05）；72 h 組：低劑量組與中、高劑量組相比均有顯著的統(tǒng)計學差異（P ＜0.01），中劑量組與高劑量組相比，有顯著的統(tǒng)計學差異（P ＜0.01）。說明人參皂苷Rg3對HT-29細胞生長的抑制作用與藥物濃度的增加及作用時間延長而增強（見表3）。

表3 人參皂苷Rg3對HT-29細胞生長的抑制率(%，±s)

表3 人參皂苷Rg3對HT-29細胞生長的抑制率(%，±s)

注：與25 μg/mL組相比，aP＜0.01；與50 μg/mL組相比，bP＜0.01

不同劑量組（μg/mL）25 50 100 24h 21.17±1.85 23.30±3.20 31.83±4.89a、b 48h 29.27±2.45 35.73±2.83a 38.20±1.39a 72h 36.10±2.55 42.80±3.48a 48.33±1.65a、b

3 討論

人參皂苷Rg3為近年從人參根的浸出液中分離出的一種有效成分，是一種微量四環(huán)三萜皂苷。大量研究顯示具有抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤新生血管形成、誘導腫瘤細胞凋亡[1]，抑制腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移和提高機體免疫功能的作用。 人參皂苷Rg3 還可以抑制腫瘤細胞的黏附、浸潤、增殖，抗腫瘤新生血管的形成，提高機體免疫功能以及與化療藥聯(lián)合應用的減毒增效作用，從而有顯著的抗腫瘤作用。

MMPs是在降解細胞外基質(zhì)過程中起作用的一類鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，其中MMP-2、MMP-9又稱明膠酶，主要降解IV型膠原，在動脈粥樣硬化、心肌梗死及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等以細胞外基質(zhì)過度破壞為主要特征的病理過程中發(fā)揮著重要作用。降解細胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）是腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的重要步驟，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用。激活的MMPs 的活性受特定TIMPs 的調(diào)節(jié)，其中TIMP-1是MMP-9的特異性抑制劑。本實驗顯示在同一作用時段隨著人參皂苷Rg3濃度增加由0 μg/mL至100 μg/mL，各組MMP-9的表達降低；在同一人參皂苷Rg3 濃度作用下，總體上，隨著時間延長，MMP-9 的表達也降低。25 μg/mL 組未顯示出明顯抑制作用，可能與此劑量不能抑制MMP-9的表達或樣本不足有關(guān)。這與他人在其他腫瘤細胞株作用的研究相似，Xu 等[2]的研究顯示人參皂苷Rg3 降低SKOV-3 細胞MMP-9 的表達，能減少穿越Matrigel的SKOV-3 細胞數(shù)。李博等[3]Rg3 可減少乳腺癌細胞(MCF-7)分泌MMP-9,表達量隨Rg3 濃度增高而減少。本研究還顯示促進TIMP-1 的表達，并且隨著藥物濃度的增加及時間的延長而增強。TIMP-1能與活化狀態(tài)的MMP-9 以1∶1 的分子比例非共價鍵結(jié)合，形成不可逆的穩(wěn)定復合物，從而阻斷MMP-9與底物結(jié)合，抑制其酶活性。人參皂苷Rg3在本研究中下調(diào)MMP-9 的表達，促進TIMP-1 的表達，人為地調(diào)節(jié)MMP-9和TIMP-1之間的平衡，改變MMP-9/ TIMP-1 的比值，更利于發(fā)揮抗腫瘤的作用。因為總體上講ECM 與MMPs/TIMP-1 比值的關(guān)系更為密切。對HT-29 細胞增殖有抑制作用，Zhang 等[4]低劑量環(huán)磷酰胺聯(lián)合人參皂甙Rg3 抗Lewis 肺癌的血管生成而抑制腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。認為MMP-9 是腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的標志物，抑制其表達可抑制腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。人參皂苷Rg3多途徑抗腫瘤增殖及浸潤、轉(zhuǎn)移，但如何協(xié)同、在何階段協(xié)同以及對腫瘤微環(huán)境的影響尚需進一步研究。

[1]高船舟, 曲淑賢, 呂廣艷, 等. 20(R). 人參皂甙Rg3 對K562/ADM細胞凋亡誘導的研究[J]. 大連醫(yī)科大學學報, 2001, 23(3)：171-173.

[2]Xu TM, Cui MH, Xin Y, et al. Inhibitory effect of ginsenoside Rg3 on ovarian cancer metastasis. Chin Med J, 2008, 121(15):1394-1397.

[3]李博, 楊威, 鄭永晨. 人參皂苷Rg3對乳腺癌細胞表達MMP-2和MMP-9的影響[J]. 中國老年學雜志, 2005, 25(8):953-954.

[4]Zhang Q, Kang X, Zhao W. Antiangiogenic effect of low-dose cyclophosphamide combined with ginsenoside Rg3 on Lewis lung carcinoma. Biochen Biophys Res Commun, 2006, 342（3）: 824-828.