王 偉，蔣 幀，錢國英，陳吉剛

(浙江省重中之重學(xué)科實(shí)驗室 浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100)

三角帆蚌 (Hyriopsis cuminglii)又稱河蚌、三角蚌、珍珠蚌，隸屬于瓣鰓綱 (Lamellibrachia)、真 瓣 鰓 目 (Eulamellibranchia)、 珠 蚌 科(Uionidae)、帆蚌屬 (Hyriopsis)，是廣泛分布于我國淡水湖泊等水域的大型雙殼類底棲動物，也是我國特有的優(yōu)質(zhì)淡水珍珠蚌。因該蚌貝殼外形略呈不等邊三角形，背緣向上伸展成三角帆狀，故名三角帆蚌［1］。多年來，三角帆蚌的蚌病一直是制約淡水珍珠養(yǎng)殖發(fā)展的瓶頸問題之一，嚴(yán)重時大范圍內(nèi)頻繁發(fā)生。近年來，我國南方各省三角帆蚌養(yǎng)殖發(fā)展勢頭迅猛，三角帆蚌病害也呈現(xiàn)逐年增多的趨勢，造成三角帆蚌大批死亡，給三角帆蚌養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

自1982年國內(nèi)首次報道了三角帆蚌疾病病例并分離到點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌后［2］，科學(xué)家們才陸續(xù)開展了三角帆蚌死亡原因分析、疾病防治及流行規(guī)律等方面的研究。但關(guān)于三角帆蚌組織病理的相關(guān)研究和報道尚比較缺乏。劉巧林等［3］運(yùn)用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察了三角帆蚌感染瘟病后外套膜、鰓和斧足的病理變化特征。最近，鐘蕾等［4］報道了人工感染三角帆蚌病毒性疾病的組織病理學(xué)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)消化腺、胃、腸、外套膜、斧足和鰓等均出現(xiàn)大量細(xì)胞空泡化、腫大，為病毒損害的主要靶器官。本課題組在前期三角帆蚌流行病學(xué)調(diào)查中采集到典型癥狀的病蚌，分離鑒定出其細(xì)菌性病原，并以此用人工方法感染健康三角帆蚌，探討該細(xì)菌病對三角帆蚌主要組織器官的影響，旨在為三角帆蚌的病害防治研究提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)將相關(guān)結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

育珠三角帆蚌10只取自紹興大阪南大江養(yǎng)殖場，3齡，平均體長16.9 cm，飼養(yǎng)在浙江萬里學(xué)院水生生物健康養(yǎng)殖試驗室水族箱中，恒溫 (25±0.5)℃，飼養(yǎng)1周確認(rèn)無病菌后進(jìn)行人工感染試驗。三角帆蚌活病體同樣采集于紹興大阪南大江養(yǎng)殖場，為1～3齡。

1.2 人工感染

從具有明顯癥狀的蚌的病灶組織分離到4株優(yōu)勢細(xì)菌，進(jìn)行培養(yǎng)接種。試驗組注射細(xì)菌濃度為8.6×108mL-1，對照組注射的是0.01 mol·L-1的PBS緩沖液。注射總劑量為1 mL，從斧足多次點(diǎn)狀注射，注射深度為 0.5～1.0 cm。注射后置(25±0.5)℃水中飼養(yǎng)。

每天觀察并記錄試驗蚌的發(fā)病情況和死亡情況，以吐水無力、分泌大量粘液和閉殼肌收縮無力作為病蚌的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 病蚌組織的采集

對發(fā)病蚌仔細(xì)觀察，確認(rèn)具有典型病癥后取樣。分別采集病蚌和健康蚌的內(nèi)臟團(tuán)、腸道、閉殼肌、外套膜、鰓、斧足和直腸組織，以健康蚌的相應(yīng)部位組織作為對照樣品。采集的樣品迅速投入4%甲醛溶液固定24 h。

1.4 石蠟切片制作

以常規(guī)石蠟切片程序進(jìn)行脫水、透蠟、包埋，切片厚度8μm，經(jīng)常規(guī)HE染色后在顯微成像系統(tǒng)下進(jìn)行觀察和拍照。

2 結(jié)果和分析

2.1 臨床癥狀

三角帆蚌病蚌體內(nèi)有大量粘液排出，雙殼微微張開，斧足緊縮不伸展。解剖顯示，健康蚌的鰓顏色為暗黃色，而病蚌鰓組織呈褐色;健康蚌斧足和外套膜為乳白色，而病蚌的顏色為黃色;病蚌腸道有不同程度的腫大和腹水。健康和患病珍珠蚌臨床癥狀觀察結(jié)果見圖1。

圖1 健康和患病三角帆蚌的臨床癥狀比較

2.2 組織病理變化

閉殼肌。與健康蚌的閉殼肌組織相比，患病個體的閉殼肌纖維略顯膨大，細(xì)胞之間的距離較大，且肌纖維彎曲程度小 (圖2)。這些結(jié)果的原因可能是由于一些死亡的細(xì)胞由于骨架結(jié)構(gòu)的變化而造成的。

圖2 健康和患病三角帆蚌的閉殼肌組織學(xué)比較

腸道。健康蚌的腸道中含有大量空泡結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)連結(jié)成片;而在患病個體腸道組織中空泡結(jié)構(gòu)小而稀疏 (圖3)。

此外，與健康蚌相比，患病個體腸道外圍柱狀上皮較健康個體細(xì)胞核細(xì)長，這可能代表了細(xì)胞不同的分化狀態(tài)。

圖3 健康和患病三角帆蚌的腸道組織學(xué)比較

外套膜。健康個體的外套膜細(xì)胞聯(lián)系緊密，組織中間是疏松連接的組織，中間有多個空泡;而患病個體的外套膜內(nèi)部細(xì)胞已喪失細(xì)胞形態(tài)，幾乎與外周上皮細(xì)胞沒有聯(lián)系 (圖4)。

圖4 健康和患病三角帆蚌的外套膜組織學(xué)比較

肝臟。圖5結(jié)果可以看出，健康個體的肝臟細(xì)胞排列整齊，管狀組織外圍細(xì)胞排列整齊;而患者肝臟管狀組織外圍細(xì)胞排列不整齊，細(xì)胞核深染，細(xì)胞連接松散。

鰓。健康個體的鰓組織細(xì)胞排列致密，細(xì)胞核形態(tài)為長梭形;而患病個體的鰓組織細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞核形態(tài)為長圓形 (圖6)。

直腸和斧足。健康蚌直腸上皮由單層柱狀纖毛上皮細(xì)胞和少量杯狀細(xì)胞組成，與患病個體的直腸組織學(xué)沒有明顯差異 (圖7)。

從圖8可以看出，斧足組織學(xué)也沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。

圖5 健康和患病三角帆蚌的肝臟組織學(xué)比較

圖6 健康和患病三角帆蚌的鰓組織學(xué)比較

圖7 健康和患病三角帆蚌的直腸組織學(xué)比較

圖8 健康和患病三角帆蚌的斧足組織學(xué)比較

3 小結(jié)與討論

人們一致認(rèn)為蚌病防治難，主要是蚌病臨床診斷難，而病癥觀察、病蚌解剖及多種病理變化的比較是確診蚌病的重要線索［5］。本試驗對三角帆蚌人工感染細(xì)菌性疾病的病理變化進(jìn)行了全面觀察。臨床病理變化主要表現(xiàn)為病蚌腸黏膜上皮細(xì)胞有不同程度的變性和壞死;內(nèi)臟團(tuán)細(xì)胞排列不整齊，細(xì)胞核深染;鰓組織糜爛，細(xì)胞排列疏松，明顯的組織病理學(xué)改變可以為蚌病的有效診斷提供借鑒。

試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟團(tuán) (肝臟)、腸道和鰓組織是三角帆蚌發(fā)病時的主要典型病變器官。這與已報道的三角帆蚌爆發(fā)細(xì)菌性疾病時的典型癥狀相符合［5-7］。文祝友等［6］曾報道，嗜水氣單胞菌對三角帆蚌的肝臟破壞最嚴(yán)重，其次是鰓，使得鰓絲細(xì)胞排列松散，纖毛受到不同程度的破壞，再次是腸和斧足。向建國等［7］研究了三角帆蚌人工感染氣單胞菌后病理組織的顯微結(jié)構(gòu)，也發(fā)現(xiàn)肝臟、腸道和鰓組織發(fā)生了明顯的病理變化，其中鰓組織首先遭到破壞，呈現(xiàn)炎性水腫，肝組織發(fā)生嚴(yán)重變性、壞死。當(dāng)三角帆蚌發(fā)病時，最明顯的病理變化往往集中在肝臟上，說明肝臟是細(xì)菌或病毒侵染的靶器官。與三角帆蚌瘟病不同的是，有學(xué)者報道，瘟病引起的組織病理變化主要部位除了肝臟，還集中在病蚌的胃和直腸上［8］，這可能與三角帆蚌的發(fā)病類型及發(fā)病機(jī)理有關(guān)。我們認(rèn)為，細(xì)菌性疾病首先破壞的是三角帆蚌的消化系統(tǒng)和消化功能，進(jìn)而破壞呼吸系統(tǒng)直至窒息死亡。試驗結(jié)果可以為生產(chǎn)上開展三角帆蚌細(xì)菌性疾病的防治提供重要依據(jù)。

［1］ 劉凌云，鄭光美.普通動物學(xué) ［M］.3版.北京:高等教育出版社，1997:220-221.

［2］ 倪達(dá)書，葛蕊芳，葉振榮.三角帆蚌疾病的初步研究 ［J］.淡水漁業(yè)，1982(5):41-42.

［3］ 劉巧林，許寶紅，鐘蕾，等.三角帆蚌瘟病組織病理學(xué)動態(tài)變化［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2009，35(4):406-411.

［4］ 鐘蕾，肖調(diào)義，黃倢，等.人工感染三角帆蚌病毒性疾病的組織病理學(xué)觀察 ［J］.水生生物學(xué)報，2011，35(4):666-671.

［5］ 張根芳，方愛萍.淡水育珠蚌疾病臨床診斷若干重要問題的探討 ［J］.淡水漁業(yè)，1999，29(5):10-13.

［6］ 文祝友，劉曉燕，金燮理，等.三角帆蚌嗜水氣單胞菌病的病理研究 ［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2001，27(1):56-59.

［7］ 向建國，鐘蕾，黃興國.三角帆蚌細(xì)菌病病理組織的顯微結(jié)構(gòu)研究 ［J］.內(nèi)陸水產(chǎn)，2009(1):50-53.

［8］ 邵健忠，項黎新，李亞南，等.三角帆蚌瘟病的組織病理研究 ［J］.水產(chǎn)學(xué)報，1995，19(1):1-7.