吳麗麗 黃少康 李三妹 蔣星宏

（福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州 350002）

反式-10-羥基-2-癸烯酸（10-HDA）是工蜂上顎腺的主要分泌物，也是王漿中最主要的不飽和脂肪酸之一[1]。它不僅是王漿的天然保鮮劑，而且是雌性蜜蜂幼蟲級型發(fā)育過程中重要的調(diào)控因子[2]。由于上顎腺與級型發(fā)育的關(guān)系，很早就受到研究者的關(guān)注，對不同蜂種的蜂王、工蜂上顎腺中10-HDA的檢測已有不少報道。如，Plettner et al.（1993）對西方蜜蜂（Apis mellifera）的無王群采集蜂、有王群工蜂、產(chǎn)卵工蜂等的上顎腺10-HDA進行比較，未發(fā)現(xiàn)它們的10-HDA含量上有顯著差異[3]。Plettner （1997）對5種蜜蜂的蜂王和工蜂上顎腺中包括10-HDA在內(nèi)的多種成分進行了檢測，檢測表明，采自加拿大的西方蜜蜂越冬工蜂10-HDA含量高達95±15μg，采自馬來西亞的大蜜蜂（Apis dorsata）采集蜂的含量達56，從斯里蘭卡Horana采集的東方蜜蜂（A. cerana）外勤工蜂中僅檢測到0.8±0.2μg/bee，黑小蜜蜂（A.andreniformis）工蜂為3.2±0.5μg/bee，小蜜蜂（A.florea）工蜂為11±1μg/bee。說明不同蜂種間工蜂，蜂王及工蜂間上顎腺10-HDA[4]等內(nèi)容物含量存在顯著差異。

蜂王的存在是蜂群完整性與穩(wěn)定性的標志，蜂王上顎腺分泌物具抑制工蜂體內(nèi)咽側(cè)體活性，進而延遲工蜂的出巢日齡的作用[5]。有王蜂中，工蜂各項活動秩序井然；一旦失王，蜂群生物學(xué)特性以及工蜂腺體分泌物會發(fā)生顯著性變化，這在海角蜜蜂中表現(xiàn)得尤其明顯，室內(nèi)無王籠養(yǎng)的海角蜜蜂工蜂上顎腺分泌物會逐漸向蜂王方向轉(zhuǎn)化，逐漸以9-ODA為主[6]。對無王和有王狀態(tài)下小蜜蜂（A.florea）工蜂上顎腺10-HDA的檢測顯示，無王群工蜂平均含7.4μg/bee，有王群工蜂平均含10.1μg/bee，兩者之間有顯著差異[7]，說明蜂王的有無對工蜂上顎腺10-HDA有影響。與西方蜜蜂相比，中蜂（A.cerana cerana）是一種對失王狀態(tài)更為敏感的蜂種，中蜂群失王后，群內(nèi)出現(xiàn)產(chǎn)卵工蜂的時間常常比西方蜜蜂短，那么，無王后，中蜂工蜂上顎腺的分泌物是否也會有所變化？在此，在有無和無王狀態(tài)下我們對中蜂工蜂上顎腺主要的分泌物10-HDA含量進行了測定和比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無王群工蜂10-HDA的含量極顯著高于有王群工蜂，現(xiàn)具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中蜂群

中蜂由福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院提供，每群群勢為3～4足框。有王群9群，無王群7群。無王群失王1～2周，群內(nèi)無子、無工蜂產(chǎn)卵現(xiàn)象。

1.1.2 主要儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津）（色譜柱：4.6mm×250mm不銹鋼柱，填充物不定形硅膠C18鍵合相，10μm）；SPD-M20A二極管陣列檢測器（日本株式會社島津制作所）；KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（北京博醫(yī)康實驗系統(tǒng)有限公司）；流動相過濾裝置（津騰）。有機濾膜（0.45μm），一次性5ml針筒，10ml容量瓶，玻璃研磨器等。

甲醇（色譜純，德國MECK集團有限公司）；無水乙醇，磷酸（優(yōu)級純GR），對羥基苯甲酸甲酯（分析純，含量99.0%），由國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；10-HDA標準品（純度99.6%，湖北揚子江蜂業(yè)公司）。

1.2 方法

1.2.1 取樣

2010年6月10日，分別在10群中蜂有王群的巢門口抓取回巢的外勤蜂，每箱抓取工蜂約100只。從失王1～2周的7群無子、無王群中，提脾，每群取工蜂約100只以上，于-80℃冷凍保存。

1.2.2 試液的配置

（1）10-HDA標準品儲備液配制

稱取干燥后的10-HDA標準品0.0305g，用無水乙醇溶解并移入50ml容量瓶中定容。此溶液每毫升含10-HDA 0.61mg。

（2）內(nèi)標溶液配制

稱取干燥過的對羥基苯甲酸甲酯0.1671g，加無水乙醇溶解并移入250ml容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。此溶液每毫升含對羥基苯甲酸甲酯0.6684 mg。

（3）樣品溶液制備

剪取同群10只工蜂頭部，放入一研磨器中，加入少量甲醇研磨，用超聲波清洗器超聲5min促使其溶解。把研磨液移入已經(jīng)加入1ml內(nèi)標溶液的10毫升容量瓶中。研磨器潤洗2～3遍，潤洗后的液體也移入容量瓶內(nèi)，最后加甲醇定容，超聲40min后靜置過夜。用0.45μm濾膜過濾，濾液即為一待測樣本。每群制備5個樣本，無王群與有王群待測樣本均同法制備。

1.2.3 色譜方法學(xué)檢測

（1）線性關(guān)系考察

精密量取10-HDA標準品儲備液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0至10.0ml容量瓶中。精密加入內(nèi)標溶液1ml，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別吸取10μl注入液相色譜儀，210nm測定。結(jié)果表明，10-HDA進樣量（X）在0.122～2.44μg范圍內(nèi)與峰面積（Y）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。回歸方程Y=2×10-5X+1.0167，R2=0.9999。

（2）精密度試驗

自動進樣10-HDA標準品10μl，重復(fù)進樣5次，測得10-HDA峰面積相對標準偏差（RSD）為0.6%（n=5），進樣方法和儀器精密度良好。

（3）穩(wěn)定性試驗

精密吸取中蜂工蜂頭部樣品10μl進樣分析，分別于1h、4h、8h、12h、24h時重復(fù)一次，測得10-HDA峰面積的RSD為1.2%，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

（4）加樣回收率試驗

準確稱取已知10-HDA含量的樣本，分別加入適量的10-HDA標準品，制備樣品溶液，進樣10μl，測得10-HDA的回收率均在95%以上。

1.2.4 樣品10-HDA含量測定

取待測樣品，按以下色譜條件進樣測定。色譜柱：20RBAX Eclipse XDB-C18，（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-0.2%磷酸溶液（55：45）；流速：1.0mL/min；檢測波長：210nm；進樣量：10μl。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)標準曲線法對HPLC檢測所得10-HDA的峰面積換算得到工蜂10-HDA的含量。用SPSS軟件中Levene test進行方差齊性檢驗，對方差齊性數(shù)據(jù)用one-way ANOVA中的LSD法對進行多重顯著性分析，對方差不齊的數(shù)據(jù)組用one-way ANOVA中Dunett T3法進行多重顯著性分析。用t-test對無王群和有王群工蜂10-HDA的含量進行差異比較。

2 結(jié)果與分析

對中蜂有王群10群及無王群7群工蜂上顎腺10-HDA含量的檢測結(jié)果見表1。有王群中，每只工蜂頭部10-HDA的平均含量為2.75±1.05μg（N=50）。不同蜂群間工蜂上顎腺10-HDA含量方差不齊，存在顯著差異（Levene test，P＝0.02＜0.05），故采用SPSS中unequal variance ANOVA的Dunett T3進行多重顯著性檢驗，檢驗結(jié)果表明，1號群的10-HDA含量顯著低于4、6、7號群（p＝0.014，0.006，0.02＜0.05）。7號群外勤蜂10-HDA含量。

平均含量高達4.76±0.41μg，顯著高于1，2，3群（P=0.02，0.05，0.032≤0.05）。2，3，4，5，8，9，10號群間無顯著差異（P＞0.05），說明多數(shù)有王群間采集蜂的10-HDA含量無顯著差異，僅個別蜂群（1和7號群）含量存在差異。由于我們的樣本未明確日齡，還不能完全排除這種差異由日齡差異引起的可能性。

無王群工蜂10-HDA的平均含量為5.47μg（N＝35），為有王群工蜂含量的2倍，極顯著高于有王群工蜂（t-test，P＝0.000＜0.01）。因為無王群各群間數(shù)據(jù)方差齊性（Levene test，P=0.58＞0.05），故采用LSD法進行多重顯著性差異比較，結(jié)果顯示，無王群中1號群工蜂10HDA平均含量均極顯著高于2至7群（P=0.004，0.000，0.001，0.000，0.000，0.000＜0.01），10-HDA平均含量達8.32μg，其余各群之間均無顯著差異（P＞0.05）。

表1 中蜂有王群和無王群工蜂10-HDA含量比較

3 討論

本試驗中所選用的無王群均為群內(nèi)無子（卵、幼蟲、蛹），且無工蜂產(chǎn)卵現(xiàn)象，工蜂主要從事花蜜采集；有王群工蜂均為回巢的工蜂，主要從事的也是采集活動，它們都不需要承擔(dān)育子的工作，上顎腺不需要為承擔(dān)哺育幼蟲而提供10-HDA，因此，蜂群對這些工蜂的功能需求可以認為是相近的，即兩種樣本之間的主要差異是有王與無王的差異。在有王狀態(tài)下，蜂王上顎腺信息素對工蜂的生理和行為都具有顯著的控制作用，能抑制工蜂上顎腺向蜂王方向轉(zhuǎn)變，因此，我們認為，中蜂無王群工蜂10-HDA平均含量顯著高于有王群工蜂的現(xiàn)象主要與蜂群的無王狀態(tài)有關(guān)，即失無王狀態(tài)導(dǎo)致中蜂群內(nèi)工蜂的10-HDA含量顯著上升，而這種變化的出現(xiàn)，可能是因為無王群中沒有了蜂王上顎腺信息素抑制因子的存在，從而對工蜂咽側(cè)體產(chǎn)生影響，進而影響保幼激素（JH）的分泌，再對上顎腺產(chǎn)生影響的調(diào)控途徑完成。但本試驗結(jié)果與小蜜蜂[7]中的報道現(xiàn)象不同，具體原因尚不清楚。因為本次沒有對測試工蜂的日齡進行控制，所以仍有必要進一步研究加以驗證，同時，搞清這種變化的內(nèi)部生理機制有助于揭示10-HDA的調(diào)控機制。

[1] 徐響，孫麗萍，董捷. 蜂王漿中脂類脂肪酸組成的研究. 2009,30(14):213-214.

[2] Spannhoff A, Kim YK, Raynal NJ, et al. Histone deacetylase inhibitor activity in royal jelly might facilitate caste switching in bees. EMBO Rep. 2011,12 (3):238-43.

[3] Plettner E, Slessor K N, Winston M L, et al. Mandibular Gland Components and Ovarian Development as Measures of Caste Differentiation in the Honey Bee (Apis melliferaL.). J. Insect Physiol.1993, 39(3):235-240.

[4] Plettner E, Otis GW, Wimalaratne PDC. Species-and castedetermined mandibular gland signals in honeybees (Apis). Journal of Chemical, 1997, 23(2): 363-377.

[5] Pankiw T. , Huang Z.Y. , Winston M.L. , Robinson G.E. Queen mandibular gland pheromone influences worker honey bee. (Apis melliferaL.) foraging ontogeny and juvenile hormone titers. Journal of Insect Physiology. 1998,(44): 685-692.

[6] Simon U E, Moritz R F A, Crewe R M. The ontogenetic pattern of mandibular gland components in queenless worker bees(Apis mellifera capensisEsch). Journal of Insect Physiology. 2001, 47:735-738.

[7] Keeling CI, Slessor KN, Koeniger N, Koeniger G, Punchihewa PWK.Quantitative analysis of the mandibular gland components of the dwarf honey bee (Apis floreaFabricius). Apidologie. 2000,(31): 293-299.