張英偉, 劉 煒

(1. 旭陽煤化工集團(tuán), 北京 100070; 2. 中國科學(xué)院 青島生物能源與過程研究所, 山東 青島 266101)

微藻能源的研究進(jìn)展

Advances in the research of Microalgae Bioenergy

張英偉1, 劉 煒2

(1. 旭陽煤化工集團(tuán), 北京 100070; 2. 中國科學(xué)院 青島生物能源與過程研究所, 山東 青島 266101)

近年來, 隨著石油資源日趨枯竭、全球性能源短缺及環(huán)境污染等問題日益嚴(yán)重, 開發(fā)綠色、清潔的生物燃料代替?zhèn)鹘y(tǒng)石化燃料, 已成為國際研究熱點。在生物燃料的眾多原料中, 微藻具有光合作用效率高、含油量高、生長周期短、油脂面積產(chǎn)率高等特點,被認(rèn)為是最有潛力替代石油的生物質(zhì)資源[1]。微藻的營養(yǎng)需求非常簡單, 對環(huán)境適應(yīng)能力強, 經(jīng)過生物冶煉不僅能生產(chǎn)出生物柴油、優(yōu)質(zhì)航空汽油等多種生物燃料, 而且還能開發(fā)出平臺化合物、高蛋白食品或飼料等產(chǎn)品, 可廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)和交通領(lǐng)域[2]。本文重點針對微藻的篩選和工程改造進(jìn)行了綜述。

1 能源微藻的優(yōu)勢與問題

廉價的原料成本以及其來源的廣泛性是油脂原料選擇的關(guān)鍵因素[3]。植物由于占用耕地面積、生長周期長、受氣候影響等諸多問題, 而不能成為生物燃料油脂供應(yīng)的長久之策[4,5]。而微藻具有“不與農(nóng)爭地,不與人爭糧”的明顯優(yōu)勢[2]。微藻可利用天然海水作為培養(yǎng)基, 對于淡水資源十分缺乏的中國來說具有獨特的吸引力。發(fā)展海洋微藻產(chǎn)業(yè)可以充分利用我國廣闊的海域、鹽堿灘涂等非耕國土資源。據(jù)計算,我國鹽堿地達(dá)1 000萬hm2, 如果用1/3的鹽堿地養(yǎng)殖微藻, 所生產(chǎn)的生物柴油就可以滿足全國的燃油需求[6]。

微藻可直接利用陽光、CO2及 N、P 等簡單營養(yǎng)物質(zhì)在胞內(nèi)合成大量油脂 (主要是甘油三酯)。其光合作用效率高, 生長周期短, 倍增時間約 3～5 d,有的藻種甚至一天可以收獲兩季, 且微藻脂類含量是陸地植物遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到的[6]。研究表明高等植物種子脂肪酸含量為干重的 15%～20%, 而微藻脂肪酸含量在氮元素缺乏時可達(dá)細(xì)胞干重的80%[7], 表1比較了植物和微藻的油脂含量[8]。田原宇[10]曾經(jīng)做過測算,在1年的生長期內(nèi), 1 hm2玉米能產(chǎn)172 L生物質(zhì)燃油,1 hm2大豆能產(chǎn)446 L, 1 hm2油菜籽能產(chǎn)1 190 L, 1 hm2棕櫚樹能產(chǎn)5 950 L, 而1 hm2微藻能產(chǎn)9.5×104L[9]?，F(xiàn)在的柴油價格大約是每噸 7 000元, 而按照現(xiàn)在的發(fā)展速度, 2014年微藻生物柴油的成本可降至6 500元/a以下。這意味著在未來的數(shù)年之內(nèi), 微藻有望代替現(xiàn)在的麻風(fēng)樹和黃連木, 成為生物柴油的主要原料。1

另外, 微藻每年可固定的 CO2大約占全球凈光合產(chǎn)量的 40%[11]。我國 CO2減排任務(wù)非常繁重, 中國煤炭行業(yè)的產(chǎn)能目前在30×108～31×108t, 1 t煤產(chǎn)生 2.5 t的二氧化碳排放, 因此, 碳吸收和碳利用是今后一個很重要的方向[12]。微藻通過光自養(yǎng)生長過程, 大規(guī)模吸收工業(yè)廢氣中的 CO2, 在實現(xiàn) CO2減排的同時, 生產(chǎn)大量的氧氣和油脂 (1 t藻約可固定2 t CO2), 既可大幅度降低能源微藻培養(yǎng)成本, 又可從清潔能源發(fā)展機(jī)制(Clean development mechanism,CDM) 中獲得收益。由于生物柴油的市場需求量極大 (我國每年需求的柴油量約1 億t, 如全部通過光自養(yǎng)培養(yǎng)的能源微藻來生產(chǎn), 約需要 3 億 t干藻粉,可吸收約6 億tCO2), 因此微藻能源產(chǎn)業(yè)的發(fā)展為緩解我國CO2減排的壓力帶來了新的希望[13]。

表1 各種生物原料油脂含量的比較

然而, 微藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展中還存在成本高、生產(chǎn)效率低等若干瓶頸問題, 嚴(yán)重制約了產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。其根本原因是由于目前微藻產(chǎn)業(yè)規(guī)模小, 很多關(guān)鍵技術(shù)及相關(guān)的基礎(chǔ)理論方面研究不足, 產(chǎn)業(yè)化開發(fā)缺乏基礎(chǔ)研究支撐和技術(shù)優(yōu)化與系統(tǒng)集成[13]。目前, 微藻產(chǎn)業(yè)亟待解決以下問題：優(yōu)質(zhì)能源微藻的選育和基因工程構(gòu)建; 低成本、高密度培養(yǎng)體系的建立; 高效、低成本光生物反應(yīng)器的開發(fā); 高效率、低成本的采收技術(shù); 微藻的高效能源轉(zhuǎn)化技術(shù)等。以上關(guān)鍵技術(shù)的不斷突破, 必將大大促進(jìn)微藻生物柴油的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

2 微藻的種類

微藻是一類細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單、生物速度快的原核或真核光合微生物。微藻種類繁多, 真核微藻包括綠藻、硅藻等, 而原核微藻主要指藍(lán)藻[14-15]。微藻廣泛分布于淡水、海水和陸地中, 預(yù)計全球微藻種類超過50 000種, 但現(xiàn)已經(jīng)鑒定的微藻只有30 000種[16]。在過去的幾十年中, 微藻研究已在全球掀起一股熱潮, 世界各地還逐步建立了相應(yīng)的藻類保藏中心。葡萄牙科英布拉大學(xué)(University of Coimbra)的淡水微藻保藏中心保存了來自全球超過 4 000多株的淡水微藻; 德國哥廷根大學(xué)(Goettingen University)保存的藻類中77%為綠藻, 8%為藍(lán)藻; 日本的NIES擁有超過2 150多株約700種的藻類[2]。這些中心保存的微藻可供各國學(xué)者進(jìn)一步探索微藻的廣泛用途。

3 高脂微藻的篩選

很多微藻都富含豐富的脂類物質(zhì),但不同微藻油脂含量有明顯差異。高產(chǎn)油率是提高微藻生物柴油效率與降低成本的必要條件。以高產(chǎn)油率為標(biāo)準(zhǔn), 油藻需滿足兩個基本要求：較高的含油量和較快的生長速率[17]。美國能源部 1978年就立項支持利用藻類制備生物柴油的研發(fā)工作, 從海洋和湖泊中分離了3 000多種藻類, 從中篩選出300多種生長快、含油高的硅藻、綠藻和藍(lán)藻等藻種[18]。近年來, 各國學(xué)者也紛紛利用各種方法篩選微藻, 表2列舉了不同種類微藻的油脂含量[2]。從表2中可以看出, 一些微藻油脂含量可達(dá)干重的 75%, 但產(chǎn)率很低, 如布朗葡萄藻(Botryococcus braunii); 其他多數(shù)微藻, 如小球藻(Chlorella), 隱甲藻(Crypthecodinium), 細(xì)柱藻(Cylindrotheca), 杜氏藻(Dunaliella), 金藻(Isochrysis), 微球藻(Nannochloris), 微擬球藻(Nannochloropsis), 新綠藻(Neochloris), 菱形藻(Nitzschia), 三角褐(Phaeodactylum), 紫球藻(Porphyridium), 扁藻(Tetraselmis)等, 含油量在 20%到50%之間, 但相應(yīng)的產(chǎn)率較高。

各類微藻中脂肪酸的組成也是篩選能源微藻的一項重要指標(biāo), 因為脂肪酸組成的不同將直接影響后期微藻燃料的品質(zhì)[2]。Thomas等[19]分析了7種淡水微藻中的脂肪酸組成, 研究表明, 這7種微藻都能合成 C14：0, C16：0, C18：1, C18：2, 和 C18：3 脂肪酸;其他一些鏈長的脂肪酸具有種屬特異性, 如纖維藻(Ankistrodesmussp.)中產(chǎn)生的 C16：4 和 C18：4 脂肪酸,金藻(Isochrysissp.)中產(chǎn)生的 C18：4 和 C22：6 脂肪酸,以及微球藻和菱形藻(Nannochlorissp.)中產(chǎn)生的C16：2、C16：3 和 C20：5 脂肪酸。

在眾多微藻中, 硅藻因其藻體細(xì)胞內(nèi)較高的脂肪含量, 被認(rèn)為是最有可能實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)油脂的藻類之一[20], 這不僅是由于硅藻中極高的油脂含量,還因為其中包含了大量多不飽和脂肪酸[21]。近30年來, 對硅藻脂肪酸含量及組成的研究也在不斷進(jìn)行中[22]。 Dunstan等[23]研究了14種海洋硅藻脂肪酸組成, 測得海洋硅藻主要脂肪酸分別為：14：0、16：0、16：1、20：5(EPA), 并且 22：6(DHA)的相對含量也在4%左右。李荷芳等[24]研究新月菱形藻、三角褐指藻、舟形藻、牟氏角毛藻的脂肪酸組成, 也得到了相同的結(jié)論。

此外, 產(chǎn)油微藻的篩選還要綜合考慮其他因素,例如是否可利用容易獲得的、簡單的營養(yǎng)物質(zhì)生長,或者是否能在特殊的環(huán)境下生長等。

4 環(huán)境因子對微藻脂類積累的影響

研究表明溫度、鹽度等諸多因素都能影響微藻油脂的積累和組成。Rao等[25]發(fā)現(xiàn)不同的鹽度對微藻的總脂含量會產(chǎn)生不同的影響?？婂\來等[26]已經(jīng)在實驗中證明, 鹽度的提高有利于 2種綠藻Pyramidomonassp.和ChlorophyeeaeL-4積累脂肪。這可能是因為在高滲透壓的環(huán)境下, 微藻需要降低脂肪含量來減弱膜的流動性, 以免更多有害離子流入細(xì)胞內(nèi)。但鹽度對微藻脂類積累的影響因藻種的

不同而有所差異。韋芳三等[27]報道鹽藻的總脂肪含量在鹽度40時最大, 100時最小, 并且當(dāng)鹽度大于40時, 總脂肪含量隨鹽度的增加呈現(xiàn)微略變小的趨勢。

表2 不同種類微藻的油脂含量及產(chǎn)率

溫度是影響微藻脂肪含量和脂肪酸種類的重要因子之一, 不同藻種的脂肪酸最適合成溫度不同[28]。蔣漢明等[29]研究了不同溫度下, 三角褐指藻和等鞭金藻生長及脂肪酸組成。結(jié)果表明, 低溫有利于三角褐指藻積累多不飽和脂肪酸, 但含量在 10～20℃之間差異不顯著; 然而等鞭金藻中多不飽和脂肪酸含量在20℃時達(dá)到最大。Zhu等[30]發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度從30℃降到 15℃時,Isochrysis galbana中二十二碳六烯酸(DHA)和亞麻酸 18：3(n-3)的含量明顯升高, 并達(dá)最高水平, 而飽和及單不飽和脂肪酸的含量下降。

Spoehr和 Milner[31]最早證明, 氮缺乏可誘導(dǎo)ChtorellaPyrenoidosa中脂類含量的增加。該現(xiàn)象后來在許多其他藻類中得到了證實。在多數(shù)情況下, 中性脂(主要是甘油三酷)因氮缺乏在細(xì)胞中增加。Liliana等[32]研究表明氮短缺或受限時, 會加快微藻細(xì)胞內(nèi)油脂的積累,Nannochloropsissp. F&M-M24在氮缺乏條件下, 油脂含量可達(dá)到 60%, 比對照提高了20%以上。Thomas等[19]證明在缺乏氮和鹽脅迫的條件下, 可促使所有檢測微藻的 C18：1 脂肪酸的增加, 并能使布朗葡萄藻(B. braunii)中產(chǎn)出C20：5脂肪酸。

Melinda 等[33]分析表明, 硅缺乏可使微藻細(xì)胞油脂含量占細(xì)胞干重的比例平均增長24%到41%。

劉志媛[34]研究了鐵對幾種不同代謝類型微藻的生長和油脂積泉的影響。在指數(shù)生長后期向培養(yǎng)基中補加 Fe3+, 使得綠藻門的小球藻的總脂含量提高到干物質(zhì)重的56.6%, 是低鐵培養(yǎng)基中小球藻的3～7倍; 在高鐵培基中屬于金藻門球等鞭金藻的總脂含量和細(xì)胞生長均高于低鐵培養(yǎng)基中的。

另外, 光照和 CO2濃度也能影響微藻的脂類合成。Liliana等[32]研究表明, 增加光強度能促使Nannochloropsissp. F&M-M24的飽和脂肪酸(14：0和16：0)和單不飽和脂肪酸(16：1n7 和 18：1n9)含量增加。Chiu等[35]研究發(fā)現(xiàn) 2%CO2與通入空氣相比可以提高微綠球藻的比生長速率和生物量, 而更高濃度的CO2則會抑制微綠球藻的生長。

5 工程微藻研究進(jìn)展

當(dāng)前, 國內(nèi)外有許多科學(xué)家在探索篩選新藻種的同時, 致力于通過研制“工程微藻”實現(xiàn)規(guī)?；B(yǎng)殖, 降低成本, 為獲取油脂資源提供一條可靠的途徑。利用基因工程改造微藻脂肪酸調(diào)控途徑, 可大大提高微藻脂肪酸的合成能力, 從而實現(xiàn)高油微藻制備生物燃料的目的。

脂肪酸合成是油脂合成的基礎(chǔ), 微藻脂肪酸合成過程涉及很多酶(圖1), 本文重點對脂肪酸生物合成階段涉及的限速酶——乙酰輔酶 A羧化酶和脂肪酸胞外分泌相關(guān)的硫酯酶進(jìn)行討論。

圖1 脂肪酸合成途徑[36]

5.1 乙酰輔酶A羧化酶研究進(jìn)展

乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, 簡寫ACC, EC 6.4.1.2), 能催化生物體中脂肪酸合成的第一步反應(yīng)[37], 即由乙酰輔酶 A(acetyl-CoA)轉(zhuǎn)化生成丙二酸單酰輔酶 A(malonyl-CoA)的反應(yīng), 為脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物的合成提供底物[38], 是脂肪酸合成的限速酶。ACC酶最早是由Wakil[39]發(fā)現(xiàn)的,隨后, 分別從菠菜、鼠和酵母細(xì)胞中獲得了ACC酶[40]。ACC對大多數(shù)生物來說是必須的, 因其具有為脂肪酸的合成提供碳源, 限制脂肪酸的合成并控制油脂沉積等功能, 備受國內(nèi)外專家學(xué)者的普遍關(guān)注[41]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展, 迄今已從多種生物體中克隆了ACC酶基因, 包括大腸桿菌、產(chǎn)油微生物、擬南芥、大豆、油菜、小麥等[42]。早在1993年, Cronan課題組就克隆了大腸桿菌ACC酶的accA和accD基因, 并與其他兩個亞基組成一個復(fù)合體共同發(fā)揮作用[43-44]。Davis等[45]在大腸桿菌中同時表達(dá)了內(nèi)源ACC酶基因和內(nèi)源硫脂酶基因tesA后, 脂肪酸合成速率提高6倍(6.6 nmol), 而在單獨表達(dá)ACC時, 由于受到底物反饋抑制作用脂肪酸產(chǎn)量較低, 僅為0.08 nmol。Lu等[46]在大腸桿菌中表達(dá)內(nèi)源ACC同時, 分別表達(dá)了植物硫脂酶和內(nèi)源硫脂酶基因, 解除了反饋抑制, 提高了工程菌脂肪酸合成能力。在5 L發(fā)酵罐培養(yǎng) 35 h時, 胞內(nèi)游離脂肪酸可到 2.5 g/L。上述研究主要是基于內(nèi)源ACC功能的研究, 但研究表明, 如果異源表達(dá)ACC可有效避免底物抑制作用[47], 提高 ACC活性, 這一策略在類黃酮生產(chǎn)中得以充分的驗證[48]。美國再生能源國家實驗室(NREL)于 1995 年將乙酰輔酶 A 羧化酶(ACCase)基因轉(zhuǎn)化小環(huán)藻成功, 實驗室條件下脂質(zhì)含量可達(dá)60% 以上, 戶外生產(chǎn)也可達(dá)40% 以上, 這是一個重要突破[49]。Dunahay 等[50]也將ACCase 基因轉(zhuǎn)化入硅藻C. cryptica和N. saprophila中, 但并未產(chǎn)生明顯的脂積累。

5.2 硫脂酶基因研究進(jìn)展

硫脂酶(thioesterase, EC：3.1.2), 廣泛存在于動植物、微生物體內(nèi), 在脂肪酸合成過程中催化水解脂酰-CoA或脂?；?ACP生成CoASH或ACP, 同時釋放出游離脂肪酸的反應(yīng)[51], 是細(xì)胞脂肪酸合成、降解和轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵酶[52]。機(jī)體代謝產(chǎn)生的脂肪酸是以胞內(nèi)脂形式貯存, 還是以游離形式存在, 就取決于硫脂酶活性的大小[53]。Voelker等[51]在大腸桿菌β-氧化缺陷菌株中表達(dá)了加州月桂Umbellularia californica的中長鏈乙酰-乙酰硫脂酶基因(AtFatA), 細(xì)胞液中游離脂肪酸含量提高了4倍。Liu等[54]在藍(lán)藻中過表達(dá)大腸桿菌硫酯酶基因‘tesA以及外源植物(U. californica、C. hookeriana和C. camphorum)的硫酯酶基因TE, 可明顯提升藍(lán)藻脂肪酸產(chǎn)量和胞外分泌能力,改造后的工程藍(lán)藻胞外脂肪酸含量可達(dá) 133 ±12 mg/day/L, 高達(dá)細(xì)胞干重的50%。

6 展望

由于富含色素、蛋白、多糖以及不飽和脂肪酸等生物活性物質(zhì), 微藻不僅可以轉(zhuǎn)化為高品質(zhì)的生物柴油、航空燃料沼氣、燃料乙醇等生物燃料, 還可直接或經(jīng)加工后用于化工、食品、醫(yī)藥和飼料工業(yè)等。目前, 微藻已實現(xiàn)規(guī)模化制備高附加值脂肪酸,如二十碳五烯酸(EPA)、花生四烯酸(ARA)、二十二碳六烯酸(DHA)等重要原料[55]; 培養(yǎng)的富含蝦青素及油脂的雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)可以實現(xiàn)生物柴油和蝦青素的聯(lián)產(chǎn)[56]。此外, 利用微藻生產(chǎn)脂肪醇、異戊二烯等平臺化學(xué)品和海藻纖維等生物基材料將成為今后微藻產(chǎn)業(yè)中的新興熱門產(chǎn)品。微藻產(chǎn)業(yè)將非常具有商業(yè)應(yīng)用前景。

然而, 我國微藻產(chǎn)業(yè)尚處于起步階段, 還存在成本過高、難以規(guī)模放大等若干瓶頸問題, 尚有許多關(guān)鍵技術(shù)有待突破, 相關(guān)工程技術(shù)需要集成。隨著對藻種選育研究和微藻的工程改造繼續(xù)深入, 培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方式等的不斷改進(jìn), 提取、分離和轉(zhuǎn)化等過程工藝的不斷完善, 微藻產(chǎn)品將具有更低的生產(chǎn)成本, 從而獲得更大的市場競爭力。

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TK6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-3096(2012)01-0132-07

2010-11-19;

2011-02-19

中國科學(xué)院知識創(chuàng)新工程重要方向項目(KGCXZ-YW-801);國家自然科學(xué)基金(20872075)

張英偉(1971-), 男, 河北保定人, 主要從事焦炭化工產(chǎn)品的研發(fā), 電話：010-63701616-408, E-mail：zhangyw@risun-group.com; 劉煒, 通信作者, 電話：0532-80662766, E-mail：liuwei@qibet.ac.cn

康亦兼)