周長春,馬 梁,董志紅

(1.四川大學(xué)國家生物醫(yī)學(xué)工程研究中心,四川成都 610044; 2.華盛頓大學(xué)機械工程系,美國西雅圖 98195-2600; 3.成都大學(xué)工業(yè)制造學(xué)院,四川成都 610106)

0 引 言

傳統(tǒng)的硬組織修復(fù)生物材料一般由不銹鋼、鈦及其合金制成,由于人體骨骼的剛性與金屬材料的剛性相差很大,導(dǎo)致金屬植入體會阻礙骨折部位周圍骨痂的快速形成,從而破壞骨骼愈合過程中應(yīng)該承受的正常應(yīng)力環(huán)境,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和骨萎縮,所以金屬類植入體材料一般需要通過二次手術(shù)取出,這給患者帶來了巨大的痛苦[6].由此,科研人員開始嘗試利用可降解吸收的生物材料來對受損硬組織進行修復(fù)重建,PLA正是其中的研究熱點之一[7-9].

作為可降解的硬組織修復(fù)材料,實體狀態(tài)的PLA材料是不具有骨傳導(dǎo)性的,唯有多孔的支架材料結(jié)構(gòu)才有利于組織細胞的粘附、生長、增殖,并利于細胞養(yǎng)料的輸送和廢棄物的排泄,而制備可控制的三維多孔結(jié)構(gòu)成為制備骨組織支架材料的關(guān)鍵[10].

本研究采用氣體物理發(fā)泡工藝,對不可共混的雙相高聚物PLA和聚苯乙烯(Polystyrene,PS)材料進行多孔支架微觀結(jié)構(gòu)設(shè)計制備研究.由于經(jīng)氣體物理發(fā)泡的單相高聚物泡沫孔隙大多為閉孔結(jié)構(gòu),而組織工程支架材料設(shè)計要求必須為三維聯(lián)通貫通孔結(jié)構(gòu),因此,本研究引入新相聚苯乙烯,以期在材料發(fā)泡以后經(jīng)溶蝕工藝處理最終形成三維可控的多孔結(jié)構(gòu),通過發(fā)泡工藝控制泡沫材料的空隙結(jié)構(gòu)和大小,從而制備具有高空隙率、聯(lián)通孔徑結(jié)構(gòu)、孔徑大小可控、可生物降解的三維多孔生物支架材料.同時,本研究還在制備的多孔支架上進行了成骨細胞的種植實驗,結(jié)果顯示,成骨細胞在支架中生長良好,增殖、分化效果明顯,經(jīng)過3周細胞種植,初步形成了三維立體的細胞團聚生長結(jié)構(gòu),成骨細胞在支架孔隙中的延伸,傳遞性良好.

1 材料與方法

1.1 材 料

實驗所用材料包括:PLA來自于Natureworks LLC(Extrusion grade,4032D),PS來自于Dow Chemical;PLA和PS以50∶50的比重率共混并注塑擠壓成形,試樣呈乳白色,厚度為0.5～0.7 mm,密度為1.162 g/cm3;發(fā)泡劑氣體來自于Airgas Nor Pac,Inc.的醫(yī)學(xué)級CO2(99.95%純度);溶解工藝中用到的有機溶劑Cyclohexane(C6H12assay by GC,corrected for water> 99.0%)與Dichloroethane(C2H4Cl2assay by GC,corrected for water>99.0%)來自于Mallinckrodt Baker, Inc.;人成骨細胞(Human osteoblast cells,cell line Hfob1.19)來自于美國標(biāo)準菌種收藏所(American Type Culture Collection,ATCC);細胞培養(yǎng)液為容積比50%的Dulbecco’s modified eagle medium(DMEM)與50%Ham’s F12的混合液,Ham’s F12混合液中同時包含了10%的胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS).

1.2 方 法

在實驗中,PLA/PS共混材料采用氣體物理發(fā)泡工藝發(fā)泡.為了優(yōu)化發(fā)泡工藝,以確定合適的氣體吸附條件并為后續(xù)制備可控孔徑的發(fā)泡材料作準備,本研究對2組不同條件的吸附實驗進行了研究:吸附二氧化碳氣體壓力分別為2、5 MPa,發(fā)泡溫度介于100℃～145℃區(qū)間調(diào)整,發(fā)泡時間選擇為25 s、30 s、45 s,每組參數(shù)至少重復(fù)5個試樣.在溶解工藝中,利用Cyclohexane與Dichloroethane試劑對 PLA、PS、PLA/PS共混材料、PLA/PS發(fā)泡材料等分別進行了溶解實驗研究,將試樣材料浸沒在溶液中持續(xù)進行24 h到一周的溶解測試,期間按時間段取出試樣,清洗、干燥、稱量,以確定合適的溶劑.

2 多孔支架材料表征

制備好的發(fā)泡材料首先應(yīng)對其材料特性進行測定,如材料相對密度測定,SEM微觀結(jié)構(gòu)觀察,材料孔徑大小測定以及空隙率測定等.本研究所用的電子掃描電鏡設(shè)備為FEI Siron X L 30 EDAX EDS,用來觀察未發(fā)泡材料及發(fā)泡后材料的微觀結(jié)構(gòu).在SEM實驗中,試樣樣品通過浸沒在液氮中冷卻脆化后,從樣品中間折斷,并在試樣斷口處噴鍍上一層薄金膜.從SEM獲取的樣品圖像經(jīng)Image J圖像處理軟件來分析材料的孔徑尺寸大小及分布.發(fā)泡后材料的孔隙率可以由以下公式計算,

式中,ε為試樣的孔隙率;ρf及ρs分別為材料發(fā)泡后的密度與未發(fā)泡前的密度.發(fā)泡材料的密度可由阿基米德排水法測得,具體執(zhí)行標(biāo)準根據(jù)ASTM D-792 standard測定,其計算公式為,

式中,ρ為試樣密度,wa為樣品在空氣中測得的重量,wb為樣品浸沒在蒸餾水中所測得的重量,ρw為所用蒸餾水的密度,該值在室溫下為0.9975 g/cm3.

目前我國對PBL教學(xué)效果的評價尚無統(tǒng)一標(biāo)準，大多選擇主觀評價或主觀評價法與考核法相結(jié)合方式，大致從以下幾方面進行評價：

3 成骨細胞種植

未發(fā)泡及發(fā)泡過后的PLA/PS共混試樣在經(jīng)過溶蝕處理后都被用于種植培育細胞.種植細胞前,所有試樣均用清水漂洗多次,再用70%的乙醛浸泡30 min消毒,然后用紫外光照30 min殺菌.滅菌后的試樣先浸泡在細胞培育液中3 d,預(yù)培養(yǎng)時,細胞首先被培育在含有DMEM培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)瓶中,培育環(huán)境為34℃以及5%CO2.預(yù)培養(yǎng)完成后,該細胞用0.25%的胰島素經(jīng)轉(zhuǎn)速為1 000 rpm的離心機離心5 min從培養(yǎng)液中分離出來,去除頂層液體,將分離出來的細胞置于干凈的皮氏培養(yǎng)皿中.然后,細胞以大約5×105個/mL的密度直接種植在準備好的試樣中,1 d后細胞附著在試樣上,其后,再往試樣上添加2 mL的培養(yǎng)液,之后將試樣放置在34℃,5%CO2的環(huán)境下進行細胞培育.

同時,為了更好地觀察試樣內(nèi)的細胞生長情況,本研究將細胞進行了染色處理.實驗中,細胞采用Live/dead viability/cytotoxicity kit(Invitrogen)染色,該物質(zhì)包含2種熒光染料:Calcein AM與 EthD-1.其中,Calcein AM可以很好地在活細胞中保留并顯示出較強的綠色熒光(顯示波長范圍:ex/em 495 nm/ 515 nm),而EthD-1則通過受損的細胞膜進入到細胞內(nèi)部與核酸結(jié)合產(chǎn)生紅色的熒光.EthD-1只能對死細胞進行染色.這樣,活(死)細胞便可以通過此染色物質(zhì)進行區(qū)分.最后,用熒光顯微鏡(LEICA M250 FA)觀察細胞繁殖情況.

4 實驗結(jié)果

4.1 發(fā)泡可控工藝參數(shù)對支架孔隙的影響

在氣體物理發(fā)泡工藝中,有2個因素將影響發(fā)泡材料的泡沫空隙及特性,即發(fā)泡時試樣所吸附的CO2氣體濃度及發(fā)泡能量.其中,發(fā)泡能量又由發(fā)泡過程中的發(fā)泡溫度和發(fā)泡時間所決定.對吸附同等氣體濃度的試樣來說,發(fā)泡工藝參數(shù)對發(fā)泡材料的泡沫孔徑有著直接影響,它們構(gòu)成了發(fā)泡工藝的可控工藝參數(shù).表1所示為本研究中采用的可控工藝參數(shù).

表1 實驗采用的氣體物理發(fā)泡工藝參數(shù)

發(fā)泡工藝參數(shù)對發(fā)泡材料泡沫孔徑的影響如圖1所示.

圖1 發(fā)泡工藝參數(shù)對發(fā)泡材料泡沫孔徑的影響

從圖1可看出,在發(fā)泡溫度為100℃～125℃區(qū)間,發(fā)泡材料的泡沫孔徑尺寸呈遞增趨勢,該值由20μm增加到70μm.當(dāng)發(fā)泡溫度超過125℃以后,發(fā)泡材料的泡沫孔徑尺寸則呈遞減趨勢,孔徑由70 μm減小到50μm左右;比較不同的發(fā)泡時間可見,發(fā)泡時間為30 s的時候,得到的泡沫孔徑尺寸為最大,20 s時次之,45 s最小,并且這個現(xiàn)象對所有發(fā)泡溫度都呈一致規(guī)律變化.其原理是:在發(fā)泡過程中,材料內(nèi)部首先形成無數(shù)的泡沫初核,不同的發(fā)泡溫度意味著不同的發(fā)泡能量,它們將產(chǎn)生不同數(shù)量的泡沫初核,這些泡沫初核隨著發(fā)泡時間的延續(xù)逐漸長大,在未達到發(fā)泡能量極值/臨界點之前(如在本實驗中發(fā)泡溫度為100℃～125℃區(qū)間),溶解吸附在聚合物矩陣中的CO2氣體由于發(fā)泡能量的驅(qū)使,不斷地從聚合物矩陣中擴散到成形的泡沫氣核中,促使了泡沫的長大,泡沫的尺寸孔徑呈現(xiàn)遞增趨勢;但在超過發(fā)泡能量極值/臨界點之后,由于發(fā)泡能量過高,高溫致使聚合物材料軟化,無法繼續(xù)支撐過度膨脹的氣泡,因而一部分氣體將從破裂的材料表皮或側(cè)面逸出,從而導(dǎo)致泡沫壁破裂、坍塌,使得泡沫孔徑尺寸減小.

不同的氣體吸附壓力與濃度對材料的泡沫孔徑影響如圖2所示.

圖2中,圖2(a)的氣體吸附壓力為2 MPa,發(fā)泡時CO2的濃度為5.31%,其泡沫孔徑大小為10μm～20μm,圖2(b)的氣體吸附壓力為5 MPa,發(fā)泡時CO2的濃度為9.23%,其泡沫孔徑大小為20μm～40 μm.圖2中,亮白色的區(qū)域為PLA材料相,暗黑色的區(qū)域為PS相,鑲嵌于發(fā)泡后的PLA矩陣中,從圖2可看出,PLA相和PS相各自團聚在一起,說明它們屬于2種互不相容的材料,這為后續(xù)PS相的去除提供了可能.

圖2 不同吸附氣體壓力與濃度對發(fā)泡材料泡沫孔徑的影響

4.2 PS相去除溶蝕工藝

材料發(fā)泡后,泡沫中同時包含著PLA相和PS相,由于PS相不是一種可降解的聚合物,且PLA材料和PS材料的溶解性能不一樣.故本研究選擇環(huán)己烷(Cyclohexane)溶劑將PS相溶蝕掉,僅保留PLA相及其所具有的多孔結(jié)構(gòu),從而提高材料的孔隙率,增強其聯(lián)通性能.

發(fā)泡后的試樣PS相經(jīng)溶蝕去除工藝處理后的掃描電鏡圖像如圖3所示.

圖3 試樣PS相溶蝕去除的掃描電鏡圖像

圖3中,圖3(a)為未經(jīng)溶解處理的PLA/PS共混試樣經(jīng)過發(fā)泡后的電子掃描電鏡圖像,經(jīng)過發(fā)泡工藝,材料矩陣中可見明顯的孔隙結(jié)構(gòu),暗黑色的PS相呈團聚狀態(tài)鑲嵌于較亮的PLA矩陣之中,圖中可見一些明顯的孔隙通道,這些孔隙通道可為溶解處理提供便利以供溶液進入材料內(nèi)部,圖示泡沫孔徑尺寸大小大約為10μm～30μm.圖3(b)為經(jīng)過發(fā)泡后的PLA/PS試樣在溶解過程中的掃描電鏡圖像,圖像顯示,經(jīng)過溶解處理,絕大部分的PS相已經(jīng)被溶解去除掉了,少許的PS(圖中圓圈中所示區(qū)域)附著在PLA的泡沫孔隙中處于正在被溶蝕之中.圖3 (c)、(d)為發(fā)泡后的PLA/PS試樣經(jīng)過7 d的溶蝕處理后,PS相完全被溶蝕掉后的電子掃描電鏡圖像,圖3(c)為沿X軸折斷的橫截面圖像,圖3(d)為沿Y軸折斷的橫截面圖像,試樣在這兩個方向上的結(jié)果大致相同,泡沫尺寸進一步增大,孔隙率大為提高,且試樣在3維空間結(jié)構(gòu)下呈現(xiàn)出一種均勻、聯(lián)通的多孔中空泡沫結(jié)構(gòu),各個泡沫單元間彼此聯(lián)通.

4.3 細胞種植實驗結(jié)果

細胞經(jīng)過不同培養(yǎng)時間段的生長情況如圖4所示.

圖4 細胞在經(jīng)過不同培養(yǎng)時間段的生長情況

圖4中,圖4(a)為細胞剛剛種植的情況,圖4 (b)為細胞經(jīng)過一周培養(yǎng)的情況,圖4(c)為細胞經(jīng)過兩周培養(yǎng)的情況.從圖4(a)可看出,細胞剛種植時,在試樣內(nèi)部幾乎不能看見任何細胞,可見此時細胞尚為附著、擴散至支架內(nèi)部.經(jīng)過一周時間的培養(yǎng)(見圖4(b)),細胞數(shù)量有了很大的增殖,且生長情況良好.經(jīng)過2周左右的時間培養(yǎng)(見圖4(c),細胞得到了更大程度的增殖.初步統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),增殖的細胞與細胞培養(yǎng)的時間呈現(xiàn)出一種幾何數(shù)量級的增殖.支架材料的三維孔隙結(jié)構(gòu)為成骨細胞的繁殖提供了誘導(dǎo)性的組織結(jié)構(gòu),較高的孔隙率及相互聯(lián)通的孔隙為細胞的延展、細胞養(yǎng)料及廢棄物的輸送提供了通道,從而促進了成骨細胞在支架孔隙結(jié)構(gòu)中的蔓延生長和分化傳遞.

成骨細胞在二維及三維環(huán)境中的生長情況如圖5所示.

圖5 成骨細胞在二維及三維環(huán)境中的生長情況

圖5中,圖5(a)為成骨細胞在三維多孔PLA支架材料上的生長情況,圖5(b)為成骨細胞在二維培養(yǎng)皿表面上的生長情況.從圖5(a)可以看出,成骨細胞在三維的PLA多孔支架材料上,細胞的增殖、生長情況很好,圖中熒光區(qū)域顯示為繁殖的活體細胞,它們呈球形或扁長狀在試樣內(nèi)部構(gòu)建起了一種三維特征結(jié)構(gòu),并隨著PLA的多孔結(jié)構(gòu)在生物體內(nèi)被逐漸代謝掉,新生的細胞將占據(jù)其原有的空間.因此,這類可降解的多孔支架材料可用作骨誘導(dǎo)生長或是修復(fù)、替代生物材料.從圖5(b)可以看出,盡管在二維的玻璃表面細胞的增殖生長情況很好,但是其無法構(gòu)建類似于生物體內(nèi)的三維空間結(jié)構(gòu),新生細胞無法快速有效地形成空間結(jié)構(gòu)和組織,此表明實心狀態(tài)的材料不適宜用于做誘導(dǎo)性的組織工程材料.

5 結(jié) 論

利用氣體物理發(fā)泡工藝可以制備一類多孔組織工程支架材料,支架的空隙結(jié)構(gòu)可以通過調(diào)控發(fā)泡工藝中的可控參數(shù)進行優(yōu)化設(shè)計.氣體物理發(fā)泡過程中,氣體的吸附壓力、吸附時間,發(fā)泡過程中的發(fā)泡溫度、發(fā)泡時間將對材料的最終孔隙結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響.發(fā)泡后對材料進行溶蝕工藝處理,可以有效去除掉鑲嵌的不可共混PS相,從而獲得具有聯(lián)通特性的孔隙結(jié)構(gòu).通過對該支架材料進行成骨細胞種植實驗,結(jié)果表明,細胞在支架內(nèi)生長情況良好,經(jīng)過2周培養(yǎng),細胞初步表現(xiàn)出三維空間蔓延傳遞生長的特征.對比二維以及三維成骨細胞種植結(jié)果發(fā)現(xiàn),盡管在二維的玻璃表面細胞的增殖生長情況很好,但其無法構(gòu)建類似于生物體內(nèi)的三維空間結(jié)構(gòu),新生細胞無法快速有效地形成空間結(jié)構(gòu)和組織,表明實心狀態(tài)的材料不適宜用做誘導(dǎo)性的組織工程材料.本研究表明,經(jīng)此方法制備的多孔支架材料有望進一步研究開發(fā)而成為一種優(yōu)良的用于組織工程修復(fù)的生物材料.但需要說明的是,許多研究工作,包括材料的力學(xué)性能表征、生物特性評估以及動物體內(nèi)實驗等,還有待進一步深入.

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