董 毅 程艷香
宮頸癌是1種常見的婦科惡性腫瘤,晚期或復(fù)發(fā)患者治愈率不高、預(yù)后極差,尋求新的治療靶點已成為近年來的研究熱點。環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)在許多腫瘤組織中高表達,與腫瘤細(xì)胞增殖、抗凋亡和腫瘤血管生成關(guān)系密切。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)在多種實體腫瘤中表達明顯上調(diào),促進腫瘤細(xì)胞在低氧環(huán)境下的生存和增殖,抑制其凋亡,并與腫瘤血管的生成密切相關(guān)。本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中COX-2和HIF-1α的表達,探討其在宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及兩者的相關(guān)性。
選取2008年5月~2010年12月本院收治的40例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織標(biāo)本為實驗組,相應(yīng)癌旁正常宮頸組織標(biāo)本為對照組;癌旁正常宮頸組織為腫瘤邊緣經(jīng)病理學(xué)檢查無腫瘤細(xì)胞浸潤的組織?;颊吣挲g28~71歲,平均年齡(40.73±9.56)歲;所有患者術(shù)前均未接受放化療,術(shù)后病理檢查確診為宮頸鱗狀細(xì)胞癌。本研究所有標(biāo)本采集均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),并獲得患者或家屬的知情同意書。
1.2.1 主要試劑 兔抗人COX-2多克隆抗體和兔抗人HIF-lα多克隆抗體購自武漢博士德公司。β-action一抗、二抗購自美國Santa Cruz公司。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑及免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
1.2.2 免疫組化方法 將標(biāo)本立即經(jīng)甲醛固定,石蠟包埋切片(厚度 4 μm ),微波處理切片后常規(guī)脫蠟水化,3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,正常山羊血清封閉,依次加一抗、二抗及鏈霉素-過氧化物酶,DAB 顯色,蘇木精復(fù)染,透明封片。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗、二抗作陰性對照。
1.2.3 免疫組化結(jié)果判定 光鏡下在每張切片中隨機選取10個高倍視野,COX-2和HIF-1α陽性著色均呈棕黃色,主要位于胞質(zhì),尤以核周明顯。凡染色強度明顯高于背景為陽性表達。將陽性細(xì)胞按其數(shù)量及顯色強度分為4級:無陽性細(xì)胞表達的為( - ) ;表達陽性細(xì)胞數(shù)不多于10 %,染色強度為弱陽性或僅個別細(xì)胞呈中至強陽性染色 ,即為表達弱陽性( + ) ;陽性細(xì)胞數(shù)為 60 %以上為中至強陽性者,少數(shù)細(xì)胞可為弱陽性,即為表達強陽性(+++);表達的陽性細(xì)胞數(shù)及強度介于上述兩者之間者為陽性(++) 。
采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行處理,計數(shù)資料進行χ2檢驗,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。
免疫組化顯示COX-2主要表達于胞質(zhì)中,HIF-1α蛋白陽性表達主要位于胞質(zhì)和胞核,均呈深棕色或黃褐色,彌漫性或灶性分布。宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織COX-2和HIF-1α的陽性表達率分別為67.5%(27/40),60.0%(24/40),均明顯高于癌旁正常宮頸組織的27.5%(11/40)、22.5%(9/40) (χ2=12.832,P=0.000;χ2=11.605,P=0.001)。
宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中COX-2和HIF-1α表達呈顯著正相關(guān)(γ=0.482,P=0.002)(表1)。
表1 COX-2和HIF-1α表達的關(guān)系(例)
環(huán)氧合酶是前列腺素合成中的重要限速酶,具有COX-1和COX-2 2種異構(gòu)體。環(huán)氧合酶-2(cvclooxygenase-2,COX-2)在正常組織中無表達或極弱表達,而在細(xì)胞因子、生長因子等誘導(dǎo)下可高表達。近年來,研究發(fā)現(xiàn)COX-2在許多腫瘤中高表達,可促進癌細(xì)胞的增殖,抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡,促進腫瘤血管生成,提高腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本研究顯示COX-2在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達顯著上調(diào),提示COX-2在宮頸癌中扮演重要角色。羅春芳等[1]用組織芯片技術(shù)檢測143例宮頸癌和20例癌旁正常宮頸組織中COX-2表達,發(fā)現(xiàn) COX-2在宮頸癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁正常宮頸組織,這和本研究結(jié)果一致。
缺氧是腫瘤的重要特征之一,影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是目前發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)細(xì)胞缺氧反應(yīng)的最關(guān)鍵的因子,在許多實體腫瘤中表達上調(diào),與腫瘤血管的生成、腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥性密切相關(guān)。研究表明,Cox-2與HIF-1α等在多種腫瘤中的表達存在顯著的相關(guān)[2~4]。進一步研究發(fā)現(xiàn)COX-2 可通過MAPK途徑或PI3K/Akt途徑誘導(dǎo)HIF-1的過度表達,而HIF-lα可以結(jié)合COX-2啟動子上的特異性HRE,促進了結(jié)腸腺瘤及腺癌細(xì)胞COX-2 mRNA的表達[5]。本研究顯示HIF-1在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達也呈明顯上調(diào),且與COX-2的表達呈正相關(guān),提示兩者相互調(diào)節(jié),共同促進了宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展,但具體機制有待于進一步研究。
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