蔣艷萍 曹來英 洛若愚

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)通過性傳播進(jìn)行感染，70%～90%的HPV感染個體能在1～2年時間內(nèi)自行清除病毒，一小部分的感染者體內(nèi)HPV感染持續(xù)存在，引起階梯式的惡性腫瘤發(fā)生，包括宮頸炎-宮頸上皮內(nèi)瘤變-原位癌-浸潤癌-轉(zhuǎn)移癌的發(fā)生發(fā)展。局部和全身免疫監(jiān)視系統(tǒng)的變化，決定了HPV感染的持續(xù)時間和是否發(fā)展為高級別病變，免疫逃逸在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。近年來，人們發(fā)現(xiàn)，具有免疫調(diào)節(jié)功能的吲哚胺2，3-二氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)，可能與腫瘤免疫逃逸有關(guān)，IDO通過阻斷T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性來抑制免疫反應(yīng)[1]，人類多種腫瘤組織和器官中可出現(xiàn)不同程度IDO表達(dá)。近期研究表明，在多種人類腫瘤中，CD4+CD25+Treg細(xì)胞參與抑制免疫反應(yīng)，與腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)[2]，在宮頸癌的間質(zhì)和上皮組織中表達(dá)增強(qiáng)[3]，參與疾病的發(fā)生。本文檢測HPV感染相關(guān)宮頸疾病(宮頸炎、CINⅠ～Ⅲ、宮頸癌)中Treg細(xì)胞和IDO表達(dá)的變化，初步探討Treg細(xì)胞和IDO在宮頸癌進(jìn)行性發(fā)生發(fā)展中的意義。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

選擇2009年7月～2011年2月我院收治的194例女性患者，平均年齡為(42.2±3.8)歲，其中包括子宮肌瘤行全子宮切除患者，其正常宮頸組織作為正常對照組。32例(16%)為正常宮頸組織，30例為宮頸炎(15%)，60例(31%)為CINⅠ，27例(14%)為CINⅡ，21例(11%)為CINⅢ，24例(12%)為宮頸癌。除正常對照組，其他組患者均行HPV檢測、宮頸TCT檢查，對照組和實驗組均行宮頸病理學(xué)檢查，根據(jù)HPV高危型檢測結(jié)果和組織學(xué)結(jié)果，按病變程度分為正常宮頸(對照組)和HPV陰性(HPV-)宮頸炎、HPV陽性(HPV+)宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌6組實驗組。納入研究患者應(yīng)排除以下條件：絕經(jīng)期婦女、妊娠、慢性疾病(糖尿病、過敏、自身免疫性疾病)、急性感染、口服避孕藥、曾接受過放化療及免疫治療，合并其他臟器腫瘤。HPV檢測：宮頸組織樣本收集后送醫(yī)院檢驗科檢測。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)本采集 宮頸組織一部分用于病理檢查，一部分制成單細(xì)胞懸液用于細(xì)胞和IDO的檢測。細(xì)胞溶解于Trizol，RNA分離參照說明書進(jìn)行。

1.2.2 引物設(shè)計 從美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的Entrez核酸數(shù)據(jù)庫(Entrez Nucleotides database)中檢索，應(yīng)用設(shè)計軟件Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計，然后將設(shè)計出的引物輸入BLAST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比較，最終得到特異的引物序列。所有引物均由上海賽百勝生物公司合成。設(shè)計出的引物序列如下：IDO sense primer：5’-TTTGCTAAAGGCGCTGTTGG-3’，IDO antisense primer：5’-CCTTCATACACCAGACCGTCTGA- 3’；GAPDH sense primer：5’-ACAACAGCCT CAAGATCATCAG-3’，GAPDH antisense primer：5’-GGTCCACCACTGA CACGTTG-3’。

1.2.3 宮頸組織微量RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄合成 CDNA宮頸組織使用微量RNA提取試劑盒(QIAGEN)提取總RNA，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。用MBI逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μl，全過程在冰上進(jìn)行。

1.2.4 Q-PCR檢測 實驗中Q- PCR所用染料為SYBR Green。反應(yīng)條件均為95℃12 min，然后95℃15 s，60℃ 60 s，共45個循環(huán)。以GAPDH的表達(dá)量作為內(nèi)參照。采用SYBR Green試劑，可通過每一個PCR擴(kuò)增反應(yīng)中循環(huán)產(chǎn)物的熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行實時檢測，從而記錄產(chǎn)物量。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測宮頸組織中Treg細(xì)胞的變化 將收集的宮頸組織單細(xì)胞懸液計數(shù)，每樣本細(xì)胞數(shù)應(yīng)達(dá)到1×106個。檢測Treg細(xì)胞，加入鼠抗人CD4-FITC單克隆抗體、鼠抗人CD25-PE單克隆抗體、鼠抗人CD127-ACEXA647單克隆抗體，室溫孵育30 min。處理好的樣品應(yīng)用流式細(xì)胞儀常規(guī)進(jìn)行分析，以相應(yīng)的熒光標(biāo)記的同型對照IgG1染色細(xì)胞作為陰性對照，應(yīng)用EXPO2軟件分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS FOR WINDOWS 16統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，并采用秩和檢驗進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 HPV檢測結(jié)果

5組患者HPV檢測結(jié)果見表1。

表1 5組患者HPV檢測情況(例)

2.2 Treg細(xì)胞表達(dá)的檢測

宮頸癌、CINⅢ、CINⅡ 及CINⅠ組中，均選擇HPV高危型(+)的患者進(jìn)行Treg細(xì)胞表達(dá)檢測，宮頸炎患者分為HPV(+)宮頸炎和HPV(-)宮頸炎組。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，宮頸癌組中Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例為(10.3±2.1) %，高于CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ及HPV(+)宮頸炎組[(7.7±1.6)%、(7.2±1.5)%，(6.8±1.3)%和(7.5±1.5)%]，前5組患者又高于HPV(-)宮頸炎組及對照組[(4.1±0.8) %和(4.7±1.0) %]，P均<0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義，CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ及HPV(+)宮頸炎組間比較無明顯差異，見圖1。

2.3 IDO mRNA的檢測

宮頸癌組宮頸組織中IDO mRNA表達(dá)水平為(1.72±0.28)×103拷貝，高于CINⅢ及CINⅡ組[(1.13±0.24)×103和(1.21±0.19)×103拷貝]，這3組結(jié)果高于CINⅠ、HPV(+)宮頸炎、HPV(-)宮頸炎及對照組[(0.75.±0.09)×103、(0.68±0.10)×103、(0.71±0.08)×103和(0.62±0.09)×103拷貝]，CINⅠ、HPV(+)宮頸炎、HPV(-)宮頸炎及對照組間無明顯差異，見圖2。

圖1 7組宮頸組織中Treg/CD4+ T細(xì)胞比例

a為宮頸癌組，b為CINⅢ組，c為CINⅡ組，d為CINⅠ組，e為HPV(+)宮頸炎組，f為HPV(-)宮頸炎組，g為對照組

圖2 7組宮頸組織中IDO mRNA表達(dá)情況

a為宮頸癌組，b為CINⅢ組，c為CINⅡ組，d為CINⅠ組，e為HPV(+)宮頸炎組，f為HPV(-)宮頸炎組，g為對照組

3 討論

腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過程中會演化出種種逃避免疫監(jiān)視的方式，導(dǎo)致宿主不能有效清除腫瘤而發(fā)生耐受，腫瘤誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制目前尚未完全闡明。近年來在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤區(qū)域IDO高表達(dá)，造成局部微環(huán)境中色氨酸耗竭，同時伴有局部淋巴細(xì)胞中存在著Treg細(xì)胞水平增高的現(xiàn)象，兩者相互作用與影響，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避免疫細(xì)胞的監(jiān)視，IDO和Tregs的出現(xiàn)為研究腫瘤免疫耐受的機(jī)制提供了一個新的方向。

IDO是色氨酸的犬尿素分解代謝途徑的限速酶，能在多種細(xì)胞特別是一些涉及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)關(guān)鍵步驟細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)[4]，通過分解代謝色氨酸抑制免疫細(xì)胞功能，是機(jī)體免疫耐受功能的重要調(diào)節(jié)因子。組織局部微環(huán)境中色氨酸的耗竭對T細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，可能是腫瘤微環(huán)境中免疫耐受形成過程中的一個關(guān)鍵因素。Uyttenhove等[5]發(fā)現(xiàn)人類多種腫瘤如肺、前列腺、胰腺等器官的腫瘤組織可出現(xiàn)不同程度IDO表達(dá)。Karanikas等[6]觀察到各種類型肺癌腫瘤組織中IDO表達(dá)顯著高于鄰近正常肺組織。本研究中顯示SCC組宮頸組織中IDO mRNA高于CINⅢ及CINⅡ組，這3組結(jié)果高于CINⅠ、HPV(+)宮頸炎、HPV(-)宮頸炎及對照組，CINⅠ、HPV(+)宮頸炎、HPV(-)宮頸炎及對照組間無明顯差異。說明隨著病情進(jìn)展，即從宮頸炎、CINⅠ到CINⅡ、CINⅢ，再發(fā)展為宮頸癌，組織中IDO表達(dá)水平逐漸增高，提示隨著宮頸病變進(jìn)展，腫瘤組織已逐步建立起有利于腫瘤發(fā)展的免疫逃逸機(jī)制，可能通過表達(dá)IDO成功逃避機(jī)體免疫攻擊，使疾病發(fā)生發(fā)展。原因可能與IFN-γ能在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)IDO基因表達(dá)有關(guān)。由于HPV感染的腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ，隨病情的進(jìn)展及腫瘤壞死和局部炎癥反應(yīng)，腫瘤及周圍組織IFN-γ濃度逐漸增高，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞、宿主APCs細(xì)胞及腫瘤組織中其他浸潤細(xì)胞表達(dá)IDO，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫攻擊加速疾病進(jìn)展。

惡性腫瘤局部浸潤了各種免疫細(xì)胞，但是這些免疫細(xì)胞并不能有效清除腫瘤細(xì)胞，腫瘤局部浸潤的免疫細(xì)胞中有部分可能是充當(dāng)免疫負(fù)調(diào)節(jié)的角色，Treg細(xì)胞正是具有這一特性的免疫細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞免疫耐受以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用[7]。動物實驗研究表明去除實驗動物的Tregs可以提高抗腫瘤特異性反應(yīng)[8]，有研究表明在CIN及宮頸癌患者外周血單核細(xì)胞或CD4+T細(xì)胞中Treg細(xì)胞比例增加，如果清除CD25+T細(xì)胞能提高HPV16 E6和E7特異性輔助T細(xì)胞反應(yīng)，表明內(nèi)在的抗HPV反應(yīng)存在[9]。本文研究顯示宮頸癌患者宮頸組織中Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例分別高于CINⅢ、CINⅡ 、CINⅠ及HPV(+)宮頸炎患者；宮頸癌、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ及HPV(+)宮頸炎這5組患者Treg細(xì)胞比例高于HPV(-)宮頸炎及正常宮頸組織組患者。前期研究結(jié)果顯示，CIN病變患者宮頸組織中Treg細(xì)胞數(shù)增加，并隨病變程度的加重呈漸進(jìn)性增加，而本文研究表明，HPV陽性的CINⅠ～Ⅲ及宮頸炎患者中，Treg細(xì)胞比例無明顯差別，這與前期的研究有所出入。但是，前期研究中的CINⅠ～Ⅲ組患者包括HPV(+)和HPV(-)，而本研究的CINⅠ～Ⅲ組患者僅僅為HPV(+)，本文研究結(jié)果更能客觀說明高危型HPV感染持續(xù)存在，Treg細(xì)胞數(shù)增加，與宮頸病變的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

IDO表達(dá)與局部浸潤的Tregs細(xì)胞間存在相關(guān)性，即IDO高表達(dá)伴隨著局部浸潤Tregs比例增高，這在多個腫瘤或動物模型中已有報道[10]。IDO和Tregs間存在著一個類似于正反饋的調(diào)節(jié)環(huán)路，共同介導(dǎo)腫瘤的免疫耐受。然而Thuere等[11]卻提出Tregs只在母體蛻膜上出現(xiàn)，而IDO則在胎盤上表達(dá)，同時Tregs在妊娠早期即出現(xiàn)，而IDO在妊娠8天之后才表達(dá)，因此，Treg可能不是誘導(dǎo)IDO表達(dá)的原因，這為IDO與Tregs間相互關(guān)系的研究提出了新的挑戰(zhàn)。本文研究結(jié)果顯示，在HPV感染相關(guān)宮頸疾病的不同階段進(jìn)展中，Treg細(xì)胞比例的變化規(guī)律與IDO的變化規(guī)律不一致，但明確的是在宮頸癌中IDO高表達(dá)伴隨著Treg細(xì)胞比例的增高。

目前，生物免疫治療在惡性腫瘤的治療中取得了一定成績，但腫瘤獲得性免疫耐受機(jī)制一旦建立，應(yīng)用靶向免疫治療促進(jìn)機(jī)體免疫反應(yīng)收效甚微。IDO與Treg細(xì)胞，作為2個獨立而又相互聯(lián)系的介導(dǎo)腫瘤免疫耐受的重要因素，有可能成為重要的治療靶點和宮頸鱗癌預(yù)后的預(yù)測因子。IDO與Treg細(xì)胞相互作用的驗證，將是下一步的研究方向。

[1] Frumento G,Rotondo R,Tonetti M I,et al.Tryptophan-derived catabolites are responsible for inhibition of T and natural killer cell proliferation induced by indoleamine 2,3-dioxygenase〔J〕.J Exp Med,2002,196：459.

[2] Baecher C,Anderson DE.Immune regulation in tumor-bearing hosts〔J〕.Curr Opin Immunol,2006,18:214.

[3] Piersma SJ,Jordanova ES,van Poelgeest MI,et al.High n-umber of intraepithelial CD8+tumor-infiltrating lymphocytes is associated with the absence of lymph node metastases in patients with large early-stage cervical cancer〔J〕.Cancer Res,2007,67:354.

[4] Mellor A,Munn DH.IDO expression by dendritic cells：tolerance and tryptophan catabolism〔J〕.Nat Rev Immunol,2004,4(10):762.

[5] Uyttenhove C,Pilotte L,Theate I,et al.Evidence for a tumonal immune resistance mechanism based on tryptophan degradation by indoleamine 2,3-dioxygenase〔J〕.Nat Med,2003,9(10)：1269.

[6] Karanikas V,Zamanakou M,Kerenidi T,et al.Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) expression in lung cancer〔J〕.Cancer Biol Ther,2007,6(10):1258.

[7] Khazaie K，vob Boehmer H.The impact of CD4+CD25+Treg on tumor specific CD8+T cell cytotoxicity and cancer〔J〕.Semin Cancer Biol,2006,16(2)：124.

[8] Turk MJ,Guevara JA,Rizzuto GA,et al.Concomitant tuinor immunity to a poorly immunogenetie melanoma is prevented by regulatory T cells〔J〕.J Exp Med,2004,200(6)：771.

[9] Visser J,Nijman HW,Hoogenboom BN,et al.Frequencies and role of regulatory T cells in patients with (pre) malignant cervical neoplasia〔J〕.Clin Exp Immunol,2007,150:199.

[10] Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,et al.Immunologic se-lf-tplerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpa-chains(CD25)：Breakdown of a sinle mechanism of self-tolerance causes various autoimmune deseases〔J〕.J Immunol,1995,155(3)：1151.

[11] Thuere C,Zenclussen ML,Schumacher A,et a1.Kinetics of regulatory T cell during murine pregnancy〔J〕.Am J Reprod Immunol,2007,58(6)：514.