陳吉添 陳 瑜 吳薇紫 陳 虹

鼻咽癌是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤，特別在廣西高發(fā)，主要死亡原因?yàn)榫植课纯鼗蜻h(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Livin是凋亡抑制細(xì)胞蛋白(inhibitor of apoptosis family of proteins，IAPs)家族的新成員，在大多數(shù)惡性腫瘤中高表達(dá)，起到抑制細(xì)胞凋亡的作用[1]。Survivn基因同屬于IAP家族的成員，具有抗凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和參與血管生成的作用。Survivin在正常組織中是1個(gè)“關(guān)閉”的基因，在腫瘤組織中被激活而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]，因此被看做是腫瘤相關(guān)基因。本研究采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)鼻咽癌組織檢測(cè)鼻咽癌與鼻咽慢性炎組織中Livin和Survivin蛋白表達(dá)的情況，以了解它們?cè)诒茄拾┲械谋磉_(dá)情況及其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 材料來(lái)源

80例鼻咽癌組織標(biāo)本，均來(lái)自廣西靈山縣人民醫(yī)院2003年1月～2004年12月收治的患者。所有患者為初治病例，確診為鼻咽低分化鱗癌，未行放療和化療處理。80例中男性61例，女性19例，年齡26～72歲，中位年齡48歲。采用1992年福州會(huì)議標(biāo)準(zhǔn)分期。另取30例鼻咽慢性炎組織作為對(duì)照組。放療后隨訪截止至2010年1月。

1.2 方法

免疫組織化學(xué)檢查采用Envision兩步法。Livin鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Neomarkers公司，抗體稀釋濃度為1∶150。Survivin鼠抗人單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，抗體稀釋濃度為1∶100，即用型快捷MaxvisionTM檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)科技公司。整個(gè)過(guò)程按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每批染色均設(shè)已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液(phosphatic buffered saline，PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷

Livin表達(dá)產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞質(zhì)，少部分細(xì)胞核也有不同程度的染色，呈棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。Survivin的陽(yáng)性表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色顆粒為準(zhǔn)。由2位醫(yī)師采用雙盲法觀察每張切片。判斷陽(yáng)性判斷參照許良中等的報(bào)道[3]：首先按切片中癌細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：0分細(xì)胞無(wú)顯色；1分呈淡黃色；2分呈棕黃色；3分呈棕褐色(染色深淺需與背景著色相對(duì)比)；再按切片中陽(yáng)性癌細(xì)胞數(shù)所占的百分比打分：0分為陰性，1分為陽(yáng)性癌細(xì)胞≤10%；2分為11%～50%，3分為50%～75%，4分為75%以上。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積>3分才算免疫反應(yīng)陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，Spearman相關(guān)性分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌組織及鼻咽慢性炎組織中Livin和Survivin蛋白的表達(dá)

鼻咽癌組織及鼻咽慢性炎組織中Livin表達(dá)陽(yáng)性率分別為61.25%(49/80)和16.67%(5/30)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.352,P<0.05)；Survivin表達(dá)陽(yáng)性率分別為68.75(55/80)和20.00%(6/30)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.991,P<0.05)。

2.2 Livin和Survivin蛋白表達(dá)與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系

通過(guò)比較Livin和Survivin表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Livin蛋白表達(dá)陽(yáng)性在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)、臨床分期組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在性別、年齡及T分期等組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Survivin蛋白表達(dá)在T分期、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)及臨床分期組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在性別、年齡等組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 Livin和Survivin蛋白表達(dá)與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 Livin和Survivin蛋白在鼻咽癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

鼻咽癌組織中Livin的陽(yáng)性表達(dá)率61.25%(49/80)，Survivin的陽(yáng)性表達(dá)率為68.75%(55/80)，兩者均為陽(yáng)性者38例，經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，Livin和Survivin蛋白表達(dá)在鼻咽癌組織中表達(dá)呈顯著正相關(guān)(γ=0.239，P=0.033)(表2)。

表2 鼻咽癌組織中Livin和Survivin蛋白表達(dá)的關(guān)系(例)

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡的紊亂密切相關(guān)。凋亡受抑制將導(dǎo)致細(xì)胞存活時(shí)間延長(zhǎng)，有利于轉(zhuǎn)化突變的細(xì)胞生長(zhǎng)積累，最終導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。細(xì)胞凋亡通路和p53、C-myc、Bcl-2家族、Smac、抑制凋亡蛋白家族(IAPS)及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路構(gòu)成1個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)對(duì)凋亡進(jìn)行精細(xì)地調(diào)控。Livin是新近發(fā)現(xiàn)的1個(gè)IAPS家族成員，Ashhab等[4]通過(guò)RT-PCR證明Livin轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物因剪接方式不同有2種mRNA亞型即Livinα和Livinβ。Livin抑制細(xì)胞凋亡作用主要通過(guò)其BIR區(qū)與Caspase結(jié)合，抑制Caspase酶的活性，尤其是抑制Caspase-3/-7和Caspase-9的活性，達(dá)到阻斷凋亡受體及以線粒體為基礎(chǔ)的凋亡途徑而起作用。Livin在胚胎組織中存在，可能與生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，在正常成人的大多數(shù)終末組織中低表達(dá)或不表達(dá)[1]。研究顯示在很多人類惡性腫瘤中Livin高表達(dá)，H-B Liu等[5]研究顯示，在膀胱癌中，Livinα的表達(dá)率為39.58%(19/48)，在15例無(wú)腫瘤的組織中未見(jiàn)表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤的復(fù)發(fā)密切相關(guān)。Ihab Adb-Elrahman等[6]亦通過(guò)動(dòng)物模型的研究推斷Livin在腫瘤發(fā)生學(xué)中有著重要作用，Livin可作為腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。我們的研究結(jié)果與之類似，在鼻咽癌組織中其表達(dá)(61.25%，49/80)顯著高于鼻咽慢性炎組織(16.67%，5/30)，同時(shí)Livin的表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)、臨床分期呈顯著的正相關(guān)，提示Livin蛋白可能參與了鼻咽癌的惡性演進(jìn)過(guò)程，可作為反映鼻咽癌惡性程度的參考指標(biāo)之一。

Survivin同樣是IAP家族成員，是目前研究的熱點(diǎn)。它可以調(diào)控細(xì)胞凋亡，通過(guò)直接阻滯Caspase-3和Caspase-7的作用而抗凋亡[7]，從而有利于細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。另外它還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的功能，可對(duì)抗G2/M期凋亡的誘導(dǎo)，從而克服細(xì)胞凋亡的檢查點(diǎn)，允許變異細(xì)胞通過(guò)有絲分裂異常增殖。Survivin在多數(shù)人類腫瘤中均有過(guò)表達(dá)[2]，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示在鼻咽癌中它的表達(dá)顯著高于鼻咽炎組織，提示在鼻咽癌發(fā)生的早期過(guò)程中可能Survivin已經(jīng)被激活，并起了一定作用。目前有愈來(lái)愈多文獻(xiàn)報(bào)道Survivin在癌組織中的表達(dá)與惡性腫瘤的侵襲和預(yù)后有關(guān)。我們的研究結(jié)果亦得到了類似結(jié)論，Survivin蛋白表達(dá)在T分期、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)及臨床分期呈顯著正相關(guān)，提示了其與鼻咽癌惡性進(jìn)展的密切關(guān)系。

從理論上分析，Livin與Survivn在抑制凋亡的機(jī)理上部分相似，如都會(huì)通過(guò)抑制Caspase酶的活性，尤其是抑制Caspase-3/-7和Caspase-9的活性，達(dá)到阻斷凋亡受體及以線粒體為基礎(chǔ)的凋亡途徑而起作用，但兩者的組織構(gòu)型并不一致，作用的結(jié)果也不一樣，如Livin的作用僅局限于調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，而Survivin在腫瘤中既調(diào)節(jié)凋亡也調(diào)節(jié)細(xì)胞分化等。國(guó)內(nèi)兩者相關(guān)的報(bào)道，劉益飛等[8]在非小細(xì)胞肺癌中，Livin與Survivn兩者無(wú)相關(guān)性；而趙麗華等[9]在胃癌中的研究顯示兩者呈顯著正相關(guān)。我們的研究顯示兩者在鼻咽癌中為顯著正相關(guān)，但兩者僅是弱的正相關(guān)，說(shuō)明兩者在鼻咽癌的發(fā)生和進(jìn)展中可能存在的相互協(xié)調(diào)促進(jìn)的作用，存在著一定的聯(lián)系。但作用機(jī)制上存在著差異，可能與基因的誘導(dǎo)因素、調(diào)節(jié)因素以及傳導(dǎo)通路，以及不同腫瘤的發(fā)生進(jìn)展機(jī)理上都存在差異，有待更基礎(chǔ)和更具體的研究。

鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制受損密切相關(guān)，高表達(dá)的IAP蛋白使癌細(xì)胞凋亡耐受，這也是臨床上化療耐藥、放療不敏感等現(xiàn)象的重要原因之一。總之，Livin與Survivin的高表達(dá)在鼻咽癌的發(fā)生及發(fā)展中起了重要的作用，可能兩者是鼻咽癌細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中重要的一環(huán)，聯(lián)合檢測(cè)兩者在鼻咽癌中的表達(dá)情況，有助于評(píng)價(jià)鼻咽癌的預(yù)后情況，并為鼻咽癌的基因靶向治療提供了新的途徑。

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