柳 軍 于東升 尚 靖 孫宏斌 張陸勇

五環(huán)三萜化合物廣泛分布于自然界中，其生物活性和藥理活性豐富多樣，如抗炎、保肝、抗艾滋病、抗癌、抗糖尿病、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化和免疫調(diào)節(jié)等作用[1]。我們之前曾報(bào)道過山楂酸及其相關(guān)的五環(huán)三萜有降糖和降脂功效[2]。為了探討五環(huán)三萜在治療白血病方面的作用，我們研究了五環(huán)三萜對(duì)人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60的作用。

科羅索酸和山楂酸是天然五環(huán)三萜化合物。山楂酸富集于橄欖皮中，2α，3β-二乙酰氧基熊果-12-烯-28-酸，2α-乙酰氧基-3β-羥基熊果-12-烯-28酸均是科羅索酸的衍生物[3]。我們主要考察山楂酸、科羅索酸、2，3-二乙酰氧基科羅索酸和2-乙酰氧基科羅索酸對(duì)HL-60細(xì)胞的生長抑制作用和促進(jìn)其分化誘導(dǎo)的作用。

1 材料與方法

1.1 化合物與試劑

山楂酸(化合物1)、科羅索酸(化合物2)、2，3-二乙酰氧基科羅索酸(化合物3)和2-乙酰氧基科羅索酸(化合物4)由中國藥科大學(xué)新藥研究中心提供，純度>95%。全反式維甲酸(ATRA)、NBT購自Sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)購自Gibco Life Technologies公司，胎牛血清購自杭州四季青生物公司(Hangzhou Sijiqing Bio-material Co.，Ltd.，China)，LDH試劑盒購自南京建成生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3天傳代1次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將HL-60細(xì)胞懸液調(diào)整為1×105個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板?；衔锶苡贒MSO，用RPMI培養(yǎng)基稀釋，使最終加入培養(yǎng)基中的DMSO濃度低于0.1%。

1.3 四氮唑藍(lán)比色(MTT)法

將人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60懸液調(diào)整為1×105個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180 μL，實(shí)驗(yàn)組分別加入4種不同濃度的化合物，每組3個(gè)復(fù)孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后各孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測定其在570 nm下的吸光度。

化合物對(duì)細(xì)胞毒性作用采用LDH試劑盒檢測，嚴(yán)格按照試劑盒說明檢測細(xì)胞釋放LDH的含量。

1.4 硝基四氮唑藍(lán)還原試驗(yàn)法

細(xì)胞誘導(dǎo)分化的檢測采用改良的硝基四氮唑藍(lán)還原(NBT)試驗(yàn)法[4]。細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)4天，然后重旋于含2 mg/mL NBT的RPMI 1640培養(yǎng)基中。37℃孵育30 min，570 nm處測定吸光度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以mean ± SD表示，組間均值采用t檢驗(yàn)(n=3)，平均值與對(duì)照組采用重復(fù)測量的方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 山楂酸、科羅索酸及其衍生物對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響

HL-60細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，然后加入不同濃度的化合物，72 h后，MTT法檢測細(xì)胞增殖活性。結(jié)果表明，化合物山楂酸、科羅索酸、2，3-二乙酰氧基科羅索酸和2-乙酰氧基科羅索酸對(duì)HL-60細(xì)胞具有生長抑制作用，并呈劑量依賴關(guān)系(圖1)。

圖1 MTT法檢測山楂酸、科羅索酸及其衍生物對(duì)HL-60細(xì)胞增殖活性的影響

2.2 山楂酸、科羅索酸及其衍生物對(duì)HL-60細(xì)胞LDH含量的影響

山楂酸(1 μM)、科羅索酸(1 μM)、2，3-二乙酰氧基科羅索酸(1 μM)和2-乙酰氧基科羅索酸(1 μM)，ATRT(1 μM)和DMSO(1 μM)刺激HL-60細(xì)胞72 h后，檢測培養(yǎng)基中LDH含量。結(jié)果表明，化合物對(duì)LDH的漏出率無顯著影響(圖2)。

2.3 山楂酸、科羅索酸及其衍生物誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞NBT還原活性的作用

HL-60細(xì)胞加入山楂酸(1 μM)、科羅索酸(1 μM)、2，3-二乙酰氧基科羅索酸(1μM)和2-乙酰氧基科羅索酸(1 μM)和ATRT(1 μM)刺激72 h，然后檢測HL-60細(xì)胞中NBT陽性細(xì)胞率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山楂酸、科羅索酸及其衍生物，可以增高HL-60細(xì)胞NBT陽性細(xì)胞率,其他組與對(duì)照組比較,P均<0.01(圖3)。

圖2 山楂酸、科羅索酸及其衍生物對(duì)HL-60細(xì)胞LDH含量的影響

圖3 山楂酸、科羅索酸及其衍生物對(duì)HL-60細(xì)胞NBT陽性細(xì)胞率的影響

3 討論

目前惡性腫瘤仍居城市人口死因的首位，癌癥的治療仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。雖然五環(huán)三萜治療和預(yù)防癌癥的作用已有廣泛的研究和報(bào)道，但其影響腫瘤細(xì)胞分化誘導(dǎo)作用的報(bào)道并不多[5～7]。為了研究五環(huán)三萜對(duì)腫瘤細(xì)胞分化誘導(dǎo)的影響，本文采用山楂酸、科羅索酸及其2個(gè)衍生物，研究這4個(gè)五環(huán)三萜化合物對(duì)HL-60細(xì)胞的生長抑制作用和促進(jìn)細(xì)胞分化誘導(dǎo)的作用。HL-60細(xì)胞從急性骨髓性白血病患者獲得，可以分化為單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞[8,9]，廣泛用于研究正常細(xì)胞與白血病細(xì)胞有關(guān)增殖與分化。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)HL-60細(xì)胞分別用0.0001、0.001、0.01和0.1mmol/L的山楂酸、科羅索酸、2，3-二乙酰氧基科羅索酸、2-乙酰氧基科羅索酸處理后，細(xì)胞生長呈劑量依賴性抑制。我們通過測定NBT還原活性來檢測其誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化能力，結(jié)果表明山楂酸、科羅索酸、2，3-二乙酰氧基科羅索酸、2-乙酰氧基科羅索酸在1μM時(shí)，誘導(dǎo)NBT陽性細(xì)胞率分別為26.1%、17.2%、22.6% 和 39.6%。其中2-乙酰氧基科羅索酸誘導(dǎo)NBT減少的能力最強(qiáng)，與陽性對(duì)照化合物維甲酸NBT陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)相近。

五環(huán)三萜類化合物在植物界中的分布極為廣泛，是許多中草藥的主要有限成分。在抗腫瘤藥物的篩選中獲得了不少有活性的化合物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山楂酸、科羅索酸、2，3-二乙酰氧基科羅索酸及2-乙酰氧基科羅索酸，對(duì)HL-60細(xì)胞具有抑制其增殖作用并且具有誘導(dǎo)其分化作用，其中2-乙酰氧基科羅索酸誘導(dǎo)粒細(xì)胞性分化能力最強(qiáng)。對(duì)更多的五環(huán)三萜化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造、修飾及生物學(xué)評(píng)價(jià)，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更有潛力的低毒抗癌化合物。

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